Live-Cell Imaging under Mekanisk Stretch
Summary
A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.
Abstract
There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.
Introduction
Celler blir utsatt for mekanisk belastning i mange vev, og denne mekaniske stimuleringen har vist seg å fremme endringer i genekspresjonsmønster, frigjøring av vekstfaktorer, cytokiner eller ombygging av den ekstracellulære matriks og cytoskjelettet 1-4. De intracellulære signaler transdusert fra slike mekaniske stimuli skje gjennom prosessen med mechanotransduction 5-7. I luftveiene, er et resultat av økningen i mechanotransduction reaktive oksygenarter (ROS) 8,9 og pro-inflammatoriske cytokiner 10 pulmonal epitel-celler i nærvær av sykliske strekk- belastning. Sterke bevis tyder også på at overdreven strekk påkjenning fører til direkte skade alveolar epitel, i tillegg til de biokjemiske responser i cellene 11-14. Selv om fokuset her er først og fremst på responsen av lungeceller til mekanisk deformasjon, trasé indusert av mechanotransduction spille en nøkkelrolle i basic funksjon av mange vev i kroppen, deriblant regulering av vaskulær tone 15 og utviklingen av vekstplaten 16.
Den voksende interessen for mechanotransduction har resultert i utviklingen av en rekke enheter for påføring av fysiologisk relevante mekaniske belastninger til dyrkede celler og vev. Spesielt anordninger anvender en strekk belastning, noe som er en vanlig form for mekanisk belastning som oppleves av vev, er populære 11,17-19. Imidlertid er mange av de tilgjengelige anordninger er enten utformet som en bioreaktor for vev tekniske anvendelser eller er ikke bidrar til sanntids avbildning med strekk. Som sådan, er det behov for å utvikle verktøy og metoder som kan visualisere celler og vev i spenning for å lette etterforskningen av veier av mechanotransduction.
Heri, ble en in-plane mekanisk strek enhet konstruert og protokoller ble utviklet for å bruke multiple former for belastning til vev og celler mens tillater avbildning av de biokjemiske og mekaniske responser i sanntid (figur 1A-D). Anordningen benytter seks jevnt fordelte klemmer anordnet langs omkretsen for å gripe en fleksibel membran og anvende en in-plan, radial oppblåsthet opp til ca 20% (figur 1B). Aktiveringsanordningen kan være plassert i en cellekulturinkubator i en lengre periode, mens motoren (figur 1C) er posisjonert utenfor inkubatoren og styrt av proprietær programvare levert av motoren leverandøren. Motoren er koblet til en lineær drivenhet, som roterer en innvendig kam, som driver seks båreklemmene jevnt i spenning og avslapning.
I tillegg til den mekaniske enheten, ble tilpasset fleksible membraner laget av kommersielt tilgjengelige cellekultur klare membraner som skal anvendes i det mekaniske systemet. Deretter sirkulære vegger (med en diameter på ca.28 mm) ble laget og festet til den fleksible membranen, slik at cellene kan dyrkes kun i denne regionen av vel beskrevne stamme profil. For å bestemme hvorvidt plassering av disse membranene inne i aktiveringsanordningen ville gi enhetlig og isotrop belastning i midten av den fleksible membranen, ble elementanalyse utført ved bruk av kommersielt tilgjengelige programvarer (figur 1E-F). Den fleksible membranen ble modellert med symmetriske grensebetingelser og utnytte alle firkant elementer for mesh. De konsentriske ringer sett i konturplott av maksimal hovedstammen vist i figur 1F viser isotrop fordeling av belastningen.
Stammen oppleves av membranen ble målt ved opptak av bilder av markeringer via belastning (figur 2). Figur 2D viser at den gjennomsnittlige membran belastning målt i radiale og aksiale retninger var tilnærmet lineærmed hensyn til den anvendte motor teller opp til en maksimal lineær belastning på 20%. Det var ingen signifikant forskjell mellom de belastningsnivået målt i løpet av oppblåsthet, sammenlignet med de som ble målt under tilbaketrekking tilbake til hvilestilling. Deretter ble den forskyvning av humane bronkiale epitelceller (16HBE) og deres kjerner dyrket på den tilpassede fleksibel membran måles. Fluorescensmerkede (DAPI) kjerner av 16HBE celler ble avbildes med en 20X objektiv under et konfokal mikroskop, mens hele cellen forskyvning ble målt med bilder fase kontrast tatt opp med et digitalt mikroskop. Som vist i figur 3, er den spenning som måles ved forskyvning av kjernene var den samme som målt ved fortrengning av markeringer på membranen, opp til ~ 20% lineær belastning. Dette bekrefter at belastningen påført membranene ble overført til de adherente celler. Protokollene som beskriver bruken av den tilpassede enheten på en tradisjonell mikroskop og en atomic force microscope er gitt i de følgende trinnene.
Protocol
Representative Results
Discussion
En unik enhet for live cell imaging under mekanisk stretch ble utviklet; og denne enheten ble brukt i en protokoll for å studere lunge epitelcellelinje mechanobiology. I innledende studier ble det funnet at en enkelt holdt strekning stimulerte produksjonen av superoksyd i mitokondrie bronchial epitelceller. I tillegg ble det vist at økte nivåer av mekaniske påkjenninger forårsaket direkte skade på integriteten av et monolag av alveolære epitelceller.
For å gjennomføre disse foreløp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker at takke Fedex Institute of Technology ved University of Memphis for deres støtte. Forfatterne ønsker å takke elevene på senior design prosjektgruppe i Mechanical Engineering avdeling ved University of Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn fra University of Memphis Engineering avdeling for motorkontroll og Dr. Bin Teng og Ms. Charlean Luellen for deres hjelp i cellekultur. Dette arbeidet ble støttet av K01 HL120912 (ER) og R01 HL123540 (CMW).
Materials
| SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
| Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5×5.25×0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
| DMEM | superoxide inhibitor | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| 50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
| Hybridization oven | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
| 16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
| AFM | Asylum Research | MFP3D | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
| AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
| Finite Element Analyses | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscopes | |||
| Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |
References
- Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
- Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. . Comprehensive Physiology. , (2011).
- Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
- Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
- Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
- Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
- Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
- Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells – Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
- Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
- Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
- Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
- Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
- Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
- Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
- Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
- Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
- DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).
