التحليل الكمي من العيوب تسلق في نموذج ذبابة الفاكهة من الاضطرابات العصبية
Summary
We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.
Abstract
عيوب الحركي الناتجة عن الاضطرابات العصبية يمكن أن يكون أحد أعراض ظهور المرض في وقت متأخر، بعد سنوات من الانحطاط تحت الإكلينيكي، والاستراتيجيات العلاجية الحالية وبالتالي ليست شافية. من خلال استخدام كامل تسلسل exome، وقد تم تحديد عدد متزايد من الجينات تلعب دورا في الحركة البشري. على الرغم من تحديد هذه الجينات، فإنه ليس من المعروف كيف أن هذه الجينات هي الحاسمة لسير قاطرة العادي. ولذلك، فإن فحص موثوق بها، التي تستخدم الكائنات نموذج لتوضيح دور هذه الجينات من أجل تحديد أهداف جديدة للالفائدة العلاجية، هناك حاجة أكثر من أي وقت مضى. لقد قمنا بتصميم نسخة توعيتهم للمقايسة انجذاب بالجاذبية السلبية التي تسمح للكشف عن العيوب أكثر اعتدالا في وقت سابق، ولديه القدرة على تقييم هذه العيوب بمرور الوقت. ويتم تنفيذ في كوب فحص تخرج اسطوانة، التي أغلقت مع فيلم الحاجز الشمع. عن طريق زيادة المسافة عتبة للتسلق إلى 17.5 جم وزيادة مدة التجربة لمدة 2 دقيقة لاحظنا وجود حساسية أكبر في الكشف عن الخلل التنقل خفيفة. ويكلف فحص فعال و لا يتطلب تدريبا مكثفا للحصول على نتائج استنساخه للغاية. وهذا يجعل من تقنية ممتازة لفحص المخدرات مرشح في المسوخ ذبابة الفاكهة مع عيوب الحركة.
Introduction
يتم التعرف على الاضطرابات العصبية المدمرة مثل مرض باركنسون والتصلب الجانبي الضموري، والشلل النصفي التشنجي وراثي على نحو متزايد. لسوء الحظ، فإن معظم هذه الاضطرابات العصبية لا تزال دون معالجة. الاستخدام السريري على نطاق واسع، الاختبارات الجينية مشاركات الجينوم على نطاق مثل كله التسلسل exome أدى إلى تزايد عدد الجينات بالتورط في الاضطرابات قاطرة الإنسان. على الرغم من هذا التقدم، والتقدم المرضي من أوائل حتى مراحل متأخرة، لا يزال بعيد المنال في هذه الاضطرابات. يوفر ذبابة الفاكهة واحدة مع الأدوات الوراثية لدراسة متطلبات الجين بطريقة المكانية والزمانية التي تسيطر عليها. بالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت ذبابة الفاكهة مفيد في فحص المخدرات لظروف عصبية مثل الشلل الرعاش 1، 2 مرض الزهايمر أو الإعاقة الفكرية 3،4 5،6 والصرع وغيرها. كان هدفنا لتطوير فعالة من حيث التكلفةوفحص موثوق بها من شأنها أن تسمح تحليل الإنتاجية العالية التي من شأنها أن تكون لا تزال حساسة بما يكفي للكشف عن تغيرات صغيرة في الأداء الحركي.
هناك عدة فحوصات تستخدم لتحديد آثار الطفرات الوراثية و / أو الظروف البيئية على السلوك تسلق ذبابة الفاكهة. معظم المقايسات الاستفادة من الميل الطبيعي للذباب في الصعود، والمعروفة باسم انجذاب بالجاذبية السلبية، أو فحص التسلق. بنزر 7 اقترح في عام 1967 أن جهاز مكافحة الحالية المستخدمة لدراسة انجذاب ضوئي ويمكن أيضا أن تستخدم لدراسة gravitaxis. ومنذ ذلك الحين، Ganetsky 8 وغيرها الكثير 9 -12 قد بنيت على فحص الأولي. المبدأ هو وضع عدد معروف من الذباب في قارورة والاستفادة من قنينة بقوة ضد سطح صلب، مما تسبب في الذباب ان يسقط الى أسفل القارورة. كما هو سلوك فطري، فإن الذباب تحاول الصعود إلى أعلى القارورة، بدلا من الجاذبية. هذا الاختبار هو الكمي وmeasuوارتفعت الدقة كم عدد الذباب الماضي علامة على القارورة خلال فترة الوقت المحدد. أصبح قياس سرعة بدلا من العدد الكلي للذباب تسلق معلمة موثوقة وأظهرت عيوب في الحالات التي يكون فيها عدد من المعايير الذباب ليس كبيرا (13).
وقد أثبت الفحص تسلق مفيدة في دراسة العديد من الاضطرابات العصبية بما في ذلك مرض باركنسون 14. ومع ذلك، لاحظنا أن العيوب قاطرة قد لا تكون قابلة للكشف في وقت حيث ينظر التنكس العصبي بالفعل في دراسات باثولوجية 14. وبالتالي، استخدام الفحص التقليدي قد تحد من القدرة على دراسة المراحل المبكرة من المرض والتسبب. ظهور عيوب قاطرة خلال مراحل لاحقة من أمراض قد تعكس مرض الذي تقدم هو متقدمة جدا لإنقاذ كاملة.
هذا يثير مشكلة محتملة مع حساسية مقايسة تسلق التقليدي. عدم القدرة المحتملة للالتقليديينtional تسلق فحص للكشف عن العيوب قاطرة خفيفة ويمكن أن يعزى إلى الارتفاع الذي يطلب فيه من الذباب في الصعود. التقليدية التدابير فحص 15،16 عدد من الذباب لتسلق بنجاح على ارتفاع 2-5 سم في 10 إلى 20 ثانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد ثبت بالفعل أن تكون ذبابة الفاكهة نموذجا ممتازا في مرض 14 والظروف العصبية الأخرى 1،2 باركنسون. بالإضافة إلى الأدوات الجينية المتاحة في ذبابة الفاكهة، والحفظ جدا الجينوم من أجل الجينات المسؤولة عن الاضطرابات العصبية 19. ظهور أساليب الفحص ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Canadian Health Research Institute (CIHR) Team Grant to Dr. Bolduc (co-PI) and Dr. Guy Rouleau (PI). We would like to thank Dr. Oksana Suchowersky, Dr. Kathryn Todd, the members of the University of Alberta fly club and Dr. Clayton Dickson for help in development of the method and statistical analysis.
Materials
| Drosophila stocks | The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet. | ||
| Video camera | Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object. | ||
| Graduated cylinder | Kimble | 20028W | Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height. |
| computer | Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point |
References
- Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).
- Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory. Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).
- McBride, S. M., et al. Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome. Neuron. 45, 753-764 (2005).
- Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Génétique. 187, 523-534 (2011).
- Marley, R., Baines, R. A. Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant. Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).
- Benzer, S. Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).
- Ganetzky, B., Flanagan, J. R. On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster. Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait. Nature genetics. 31, 349-353 (2002).
- Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster. Nature protocols. 5, 20-25 (2010).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Botella, J. A., et al. The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration. Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson’s disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Chakraborty, R., et al. Characterization of a Drosophila Alzheimer’s disease model: pharmacological rescue of cognitive defects. PLoS One. 6, e20799 (2011).
- Orso, G., et al. Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine. J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).
- Lehmann, E. L., D’Abrera, H. J. M. . Nonparametrics : statistical methods based on ranks. , (2006).
- Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function. PLoS biology. 2, e429 (2004).
- Inlow, J. K., Restifo, L. L. Molecular and comparative genetics of mental retardation. Génétique. 166, 835-881 (2004).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila. Génétique. 161, 1197-1208 (2002).
