Análisis cuantitativo de los Defectos de escalada en un modelo de Drosophila de enfermedades neurodegenerativas
Summary
We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.
Abstract
Defectos locomotores resultantes de trastornos neurodegenerativos pueden ser un síntoma de aparición tardía de la enfermedad, después de años de degeneración subclínica, y por lo tanto las estrategias actuales de tratamiento terapéutico no son curativos. Mediante el uso de toda la secuenciación del exoma, un número creciente de genes han sido identificados para jugar un papel en la locomoción humana. A pesar de la identificación de estos genes, no se sabe cómo estos genes son cruciales para el funcionamiento normal locomotora. Por lo tanto, un ensayo fiable, que utiliza organismos modelo para dilucidar el papel de estos genes con el fin de identificar nuevas dianas de interés terapéutico, se necesita más que nunca. Hemos diseñado una versión sensibilizada del ensayo geotaxis negativas que permite la detección de defectos más leves anteriormente y tiene la capacidad para evaluar estos defectos en el tiempo. El ensayo se realiza en un cilindro de vidrio, que se sella con una película de barrera de cera se graduó. Al aumentar la distancia de umbral para ser subido a 17,5 cm y el aumento de la duración de la prueba a 2 min hemos observado una mayor sensibilidad en la detección de disfunciones de movilidad suaves. El ensayo es rentable y no requiere de una amplia formación para obtener resultados altamente reproducibles. Esto hace que sea una excelente técnica para el cribado de fármacos candidatos en los mutantes de Drosophila con defectos de locomoción.
Introduction
Trastornos neurodegenerativos devastadores como la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, y la paraplejía espástica hereditaria se reconocen cada vez más. Desafortunadamente, la mayoría de estos trastornos neurodegenerativos siguen sin tratamientos. El uso clínico generalizado de las pruebas genéticas, imparciales en todo el genoma como la secuenciación del exoma conjunto ha llevado a un creciente número de genes están implicados en los trastornos locomotores humanos. A pesar de este progreso, la progresión patológica desde temprano a las etapas finales de los años, sigue siendo difícil de alcanzar en estos trastornos. Drosophila ofrece uno con las herramientas genéticas para el estudio de requerimiento de genes de una manera espacial y temporal controlada. Además, Drosophila ha demostrado ser útil en el cribado de fármacos para enfermedades neurológicas como el Parkinson 1, 2 Alzheimer, discapacidad intelectual y epilepsia 3,4 5,6 entre otros. Nuestro objetivo era desarrollar un rentabley ensayo fiable que permita análisis de alto rendimiento que todavía sería lo suficientemente sensible para detectar pequeños cambios en el rendimiento del motor.
Hay varios ensayos utilizados para cuantificar los efectos de la mutación genética y / o condición ambiental en el comportamiento de escalada Drosophila. La mayoría de los ensayos de sacar provecho de la tendencia natural de las moscas para subir, conocidos como geotaxis negativos, o el ensayo de escalada. Benzer 7 sugirió en 1967 que el aparato de contracorriente utilizado para el estudio de phototaxis también podría ser utilizado para estudiar gravitaxis. Desde entonces, Ganetsky 8 y muchos otros 9 -12 se han basado en el ensayo inicial. El principio es colocar un número conocido de moscas en un vial y toque el vial firmemente contra una superficie dura, haciendo que las moscas que caen al fondo del vial. Como se trata de un comportamiento innato, las moscas se intentan subir a la parte superior del vial, se opuso a la gravedad. Este ensayo es cuantitativo y measures cuántas moscas han subido más allá de un marcador en el vial durante un período de tiempo asignado. Medida de la velocidad en lugar del número total de moscas escalada se ha convertido en un parámetro fiable y se muestra defectos en los casos en que el número de criterios moscas no fue significativa 13.
El ensayo de escalada ha demostrado ser útil en el estudio de muchos trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Parkinson 14. Sin embargo, hemos observado que los defectos de locomotoras pueden no ser detectables en el momento en que la neurodegeneración ya se ve en los estudios patológicos 14. Así, el uso del ensayo tradicional puede limitar la capacidad de estudiar las primeras etapas de la patogénesis de la enfermedad. La aparición de defectos de locomotoras durante las etapas posteriores de la patología puede reflejar una enfermedad cuya progresión es demasiado avanzado para el rescate completo.
Esto plantea un problema potencial con la sensibilidad del ensayo tradicional de escalada. La incapacidad potencial de la tradicióncional escalada ensayo para detectar defectos leves de la locomotora se puede atribuir a la altura a la que se requieren las moscas a subir. Los tradicionales ensayo de 15,16 mide el número de moscas que subir con éxito más de una altura de 2 a 5 cm de 10 a 20 seg.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila ya ha demostrado ser un excelente modelo en la enfermedad 14 y otras condiciones neurodegenerativas 1,2 de Parkinson. Además de las herramientas genéticas disponibles en Drosophila, su genoma está altamente conservada de genes implicados en los trastornos neurológicos 19. El advenimiento de los métodos de detección genética del genoma de ancho (incluyendo la secuenciación del exoma) es probable que continúe para proporcionar una lista más grande de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Canadian Health Research Institute (CIHR) Team Grant to Dr. Bolduc (co-PI) and Dr. Guy Rouleau (PI). We would like to thank Dr. Oksana Suchowersky, Dr. Kathryn Todd, the members of the University of Alberta fly club and Dr. Clayton Dickson for help in development of the method and statistical analysis.
Materials
| Drosophila stocks | The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet. | ||
| Video camera | Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object. | ||
| Graduated cylinder | Kimble | 20028W | Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height. |
| computer | Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point |
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