في فيفو التصوير وتتبع التكنيتيوم-99m إعتبر نخاع العظم الوسيطة الخلايا الجذعية في فرسي Tendinopathy
Summary
This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.
Abstract
التطورات الحديثة في تطبيق خلايا نخاع العظم الجذعية الوسيطة (BMMSC) لعلاج إصابات الأوتار والأربطة في الحصان أقترح تحسين مقاييس النتائج في كل من الدراسات التجريبية والسريرية. على الرغم من أن BMMSC يتم زرعها في آفة وتر بأعداد كبيرة (عادة 10 حتي 20000000 الخلايا)، سوى عدد قليل نسبيا البقاء على قيد الحياة (<10٪) على الرغم من أن هذه يمكن أن تستمر لمدة تصل إلى 5 أشهر بعد الزرع. هذا يبدو أن المراقبة المشتركة في الأنواع الأخرى حيث تم زرع BMMSC إلى الأنسجة الأخرى وأنه من المهم أن نفهم عند حدوث هذه الخسارة، وكيفية البقاء على قيد الحياة كثير عملية زرع الأولية وما إذا كان يتم مسح الخلايا في الأجهزة الأخرى. تتبع مصير الخلايا يمكن تحقيقه عن طريق radiolabeling وBMMSC قبل الزرع التي تسمح غير الغازية في التصوير المجراة من موقع الخلية النوعي والكمي لأعداد الخلايا.
يصف هذا البروتوكول على labeli الخليةالإجراء نانوغرام يستخدم التكنيتيوم-99m (TC-99m)، وتتبع هذه الخلايا التالية زرع في الأوتار المثنية اصابة في الخيول. TC-99m هو (ر 1/2 من 6.01 ساعة) النظائر قصيرة الأجل التي تنبعث أشعة جاما، ويمكن أن يكون داخليا من قبل الخلايا في وجود hexamethylpropyleneamine أوكسيم مجمع محبة للدهون (HMPAO). هذه الخصائص تجعله مثاليا للاستخدام في عيادات الطب النووي لتشخيص كثير من الأمراض المختلفة. يمكن اتباعها مصير الخلايا المسمى في المدى القصير (تصل إلى 36 ساعة) من خلال جاما مضان لتحديد كل من عدد من الخلايا الاحتفاظ بها في الآفة وتوزيع الخلايا في الرئتين والغدة الدرقية وغيرها من الأجهزة. ويتم تكييف هذه التقنية من وضع العلامات الكريات البيض في الدم، ويمكن استخدامها لصورة مزروع BMMSC في الأجهزة الأخرى.
Introduction
وتستند استراتيجيات التجدد لإصلاح الأنسجة المريضة أو التالفة على الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستمدة من مجموعة متنوعة من الأنسجة وزرعها في المنطقة المصابة. وقد أظهرت التطورات الأخيرة في تطبيق ذاتي BMMSC لعلاج وتر وإصابات الرباط في الحصان تحسين مقاييس النتائج في كل تجريبي 1-5 والدراسات السريرية 6. الحصان هو نموذج جاذبية خاصة لتقييم فعالية الخلايا الجذعية العلاجات المتعلقة لأنها تعاني من العمر وإرهاق الإصابات المتعلقة الأوتار من forelimb البعيدة، فمن حيوان الرياضي، وأنه هو كبير، وتسهيل الانتعاش نخاع العظام و غرس دقيقة. إصابات الأوتار تلتئم بشكل طبيعي مع التليف ولكن وتر تلتئم هو أدنى وظيفيا 7 ولها مخاطر عالية من إعادة الإصابة 8. يتأثر المثنية الرقمي سطحية وتر (SDFT) الأكثر شيوعا وتطورت لتكون بمثابة الطاقة المرنةويؤكد مخزن والخبرات تحميل عالية لتحقيق كفاءة الطاقة وسرعة عالية الحركة. استعادة وظيفة بعد الاصابة ولذلك حرجة. هذه الإصابات هي مماثلة لتلك التي تؤثر على وتر أخيل في البشر الذي يؤدي وظيفة مماثلة 9. لا توجد خيارات جيدة العلاج لعلاج أو تحقيق حالة جيدة لمثل هذه الإصابات، وتوفر استراتيجيات التجدد بالتالي، يستند خلية فرصة جذابة لتحسين النتائج والحد من إعادة الإصابة.
في معظم الدراسات 5 – يتم حقن 20 مليون BMMSC ذاتي مباشرة إلى الآفة التي تحدث عادة في غضون جوهر الجسم وتر التي بالتالي بمثابة وعاء للخلايا. مصير الخلايا مرة واحدة حقن ليست طرق وضع العلامات الخلية واضحة ومختلفة لتعقب وقد وصفت الخلايا مؤخرا. عرضت الخلايا المسمى مع علامة مضان من أجل البقاء فقط في أعداد صغيرة نسبيا (<10٪) 10،11. تسميات مضان تستلزماستخراج الأنسجة وباجتزاء للتحليل النسيجي الذي هو مضيعة للوقت و لا تسهل بسهولة التحليل الزمني في نموذج حيواني كبير أو في الحالات السريرية. في مزيد من العمل مؤخرا استخدمنا 99m النظائر المشعة ح لتسمية الخلايا واتبع مصيرهم جاما مضان 1. يسمح هذا الأسلوب مقارنات سريعة ليتم بين طرق مختلفة من تسليم خلية، بما في ذلك داخل الآفة، عن طريق الوريد عن طريق الوريد الوداجي 1 أو نضح الإقليمي عبر داخل الشرايين 12 أو عن طريق الوريد 1،12 الحقن. استمرار وتوزيع الخلايا ومن ثم يمكن تصويرها من قبل جاما مضان من مختلف الأجهزة. ويبين هذا أن 24٪ فقط من حقن الخلايا ظلت intralesionally في الآفة التي مدار 24 ساعة (1) وهذا معتمد من قبل دراسة أخرى باستخدام الآفات خلق تجريبيا وباستخدام نفس radiolabel 5. وعلاوة على ذلك، تظهر الخلايا قدرة محدودة على منزل في الآفات وتر عندما delivereد كتبها نضح الإقليمي أو عن طريق الوريد ولكنها تنتشر في الرئتين عن طريق طرق الأخيرة (4).
BMMSC المسمى مع النانوية الحديد هو طريقة بديلة لتعقب الخلايا المزروعة في الأوتار forelimb 13. على الرغم من جسيمات متناهية الصغر الحديد الخلايا المسمى تسمح تتبع خلية في الجسم الحي بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي، دراسات الزمنية في الحيوانات الكبيرة تقتصر على عدد المرات التي يمكن أن تدار التخدير في كل نقطة زمنية لتنفيذ فحوصات الرنين المغناطيسي. وعلاوة على ذلك، النانوية الحديد هي hypointense على التصوير بالرنين المغناطيسي الذي يحد من المعلومات عن هجرة الخلايا المسمى في الجسم وتر. النظائر المشعة الأخرى التي يمكن استخدامها وتشمل الإنديوم-111 ولكن هذا يعاني من عيب أطول عمر النصف من TC-99m (2.8 أيام مقابل 6.0 ساعة) وارتفاع الطاقة انبعاث أشعة غاما. بالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن بقاء الخلية أن تنخفض عندما وصفت مع الإنديوم-111 14. TC-99m، من ناحية أخرى، ويستخدم بشكل روتيني في كل من الخيول والإنسان النوويةالطب لتسمية الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي ومتابعة توزيعها في الجسم الحي من قبل مضان. ويمكن بسهولة نسبيا التي اتخذت من قبل الخلايا باستخدام HMPAO كناقل رابط لربط تكنيتيوم، كما TC-99m-HMPAO، إلى الخلايا. وصفت TC-99m-HMPAO BMMSC تظهر قابلية جيدة، ويمكن أن تتكاثر في المختبر 4. هذا البروتوكول تفاصيل وضع العلامات وتتبع BMMSC ذاتي الخيول زرعها في الآفات التي تحدث بشكل طبيعي في SDFT forelimb.
ومن المهم أن نلاحظ أن البروتوكول يهدف فقط لاستخدامها كأداة بحثية. لا ينصح استخدامه كطريقة علاجية سريرية تأثير radiolabel على النمط الظاهري الخلوية لم توضح تماما.
Protocol
Representative Results
Discussion
بالإضافة إلى نخاع العظام، والخلايا الجذعية المعزولة من مصادر مثل الأنسجة الدهنية هي مناسبة لوصفها مع هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، الخلايا من حالة تجمد يمكن إحياء وتوسيع في الثقافة إلى الأرقام المطلوبة للدراسات وسم 12.
ا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge funding from the Horserace Betting Levy Board U.K. (grant number 721) and VetCell BioScience Ltd, U.K. and by Consejerìa de Innovaciòn, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucìa, Spain.
Materials
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 h of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec – Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18G and 19G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18G); NN1938R (19G) | |
| Syringes 1 mL and 2 mL | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 mL); SYR6003 (2 mL) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
References
- Becerra, P., et al. Distribution of injected technetium(99m)-labeled mesenchymal stem cells in horses with naturally occurring tendinopathy. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1096-1102 (2013).
- Nixon, A. J., Dahlgren, L. A., Haupt, J. L., Yeager, A. E., Ward, D. L. Effect of adipose-derived nucleated cell fractions on tendon repair in horses with collagenase-induced tendinitis. American Journal of Veterinary Research. 69, 928-937 (2008).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1392-1398 (2009).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PloS one. 8, e75697 (2013).
- Sole, A., et al. Distribution and persistence of technetium-99 hexamethyl propylene amine oxime-labelled bone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimentally induced tendon lesions after intratendinous injection and regional perfusion of the equine distal limb. Equine Veterinary Journal. 45, 726-731 (2013).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 44, 25-32 (2012).
- Crevier-Denoix, N., et al. Mechanical properties of pathological equine superficial digital flexor tendons. Equine Veterinary Journal. 29, 23-26 (1997).
- O’Meara, B., Bladon, B., Parkin, T. D., Fraser, B., Lischer, C. J. An investigation of the relationship between race performance and superficial digital flexor tendonitis in the Thoroughbred racehorse. Equine Veterinary Journal. 42, 322-326 (2010).
- Alexander, R. M. Energy-saving mechanisms in walking and running. The Journal of Experimental Biology. 160, 55-69 (1991).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Monitoring the fate of autologous and allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: preliminary study. Equine Veterinary Journal. 40, 178-181 (2008).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Equine embryonic stem-like cells and mesenchymal stromal cells have different survival rates and migration patterns following their injection into damaged superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 42, 636-642 (2010).
- Sole, A., et al. Scintigraphic evaluation of intra-arterial and intravenous regional limb perfusion of allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the normal equine distal limb using (99m) Tc-HMPAO. Equine Veterinary Journal. 44, 594-599 (2012).
- Carvalho, A. M., et al. Evaluation of mesenchymal stem cell migration after equine tendonitis therapy. Equine Veterinary Journal. 46, 635-638 (2014).
- Welling, M. M., Duijvestein, M., Signore, A., van der Weerd, L. In vivo biodistribution of stem cells using molecular nuclear medicine imaging. Journal of Cellular Physiology. 226, 1444-1452 (2011).
- Dowling, B. A., Dart, A. J., Hodgson, D. R., Smith, R. K. Superficial digital flexor tendonitis in the horse. Equine Veterinary Journal. 32, 369-378 (2000).
- Kasashima, Y., Ueno, T., Tomita, A., Goodship, A. E., Smith, R. K. Optimisation of bone marrow aspiration from the equine sternum for the safe recovery of mesenchymal stem cells. Equine Veterinary Journal. 43, 288-294 (2011).
- Avella, C. S., et al. Ultrasonographic assessment of the superficial digital flexor tendons of National Hunt racehorses in training over two racing seasons. Equine Veterinary Journal. 41, 449-454 (2009).
- de Vries, E. F., Roca, M., Jamar, F., Israel, O., Signore, A. Guidelines for the labelling of leucocytes with (99m)Tc-HMPAO. Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 37, 842-848 (2010).
- Trela, J. M., et al. Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot. Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).
- Barbash, I. M., et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation. 108, 863-868 (2003).
- Heckl, S. Future contrast agents for molecular imaging in stroke. Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).
