En vivo de imágenes y Seguimiento de tecnecio-99m Etiquetada células madre mesenquimales de médula ósea en Equinos tendinopatía
Summary
This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.
Abstract
Los recientes avances en la aplicación de las células madre mesenquimales de la médula ósea (BMMSC) para el tratamiento de las lesiones del tendón y ligamento en el caballo sugieren mejoraron las medidas de resultado en los dos estudios experimentales y clínicos. Aunque el BMMSC se implantan en la lesión del tendón en grandes cantidades (generalmente 10 – 20 millones de células), sólo un número relativamente pequeño sobrevivir (<10%), aunque estos pueden persistir por hasta 5 meses después de la implantación. Esto parece ser una observación común en otras especies donde BMMSC se han implantado en otros tejidos y es importante para entender cuando se produce esta pérdida, cuántos sobreviven el proceso de implantación inicial y si las células se borran en otros órganos. El seguimiento del destino de las células se puede lograr mediante la radiomarcación de BMMSC antes de la implantación que permite no invasiva de imágenes in vivo de la localización celular y cuantificación del número de células.
Este protocolo describe un labeli celularng procedimiento que utiliza tecnecio-99m (Tc-99m), y el seguimiento de estas células después de la implantación en tendones flexores heridos en caballos. Tc-99m es un (t 1/2 de 6,01 hr) de isótopos de corta duración que emite rayos gamma y puede ser internalizada por las células en presencia de la oxima hexametilpropilenamina compuesto lipófilo (HMPAO). Estas propiedades lo hacen ideal para su uso en las clínicas de medicina nuclear para el diagnóstico de muchas enfermedades diferentes. El destino de las células marcadas se puede seguir en el corto plazo (hasta 36 hr) por escintigrafía gamma para cuantificar tanto el número de células retenidas en la lesión y la distribución de las células en los pulmones, tiroides y otros órganos. Esta técnica es una adaptación del etiquetado de los leucocitos de la sangre y podría ser utilizado para BMMSC imagen implantado en otros órganos.
Introduction
Estrategias regenerativas para la reparación de los tejidos enfermos o dañados se basan en células madre multipotentes derivadas de una variedad de tejidos e implantado en la zona afectada. Los recientes avances en la aplicación de autóloga BMMSC para el tratamiento del tendón y lesiones de ligamentos en el caballo han demostrado la mejora de las medidas de resultado, tanto experimental 1-5 y estudios clínicos 6. El caballo es un modelo especialmente atractivo para la evaluación de la eficacia de las células madre tratamientos relacionados, ya que sufre de edad y sobreesfuerzo lesiones relacionadas a los tendones de la extremidad anterior distal, es un animal atlético, y es una recuperación grande, facilitando la médula ósea y implantación precisa. Lesiones del tendón de sanar de forma natural con la fibrosis, pero el tendón sanado es funcionalmente inferior 7 y tiene un alto riesgo de una nueva lesión 8. El tendón flexor digital superficial (TFDS) se ve afectado con mayor frecuencia, ya que ha evolucionado para actuar como una energía elásticatienda y experiencias de alta carga hincapié para lograr la eficiencia energética y la locomoción de alta velocidad. Restaurar la función después de la lesión tanto, es fundamental. Estas lesiones son similares a los que afectan el tendón de Aquiles en los seres humanos, que realiza una función similar 9. No hay buenas opciones de tratamiento para tratar o lograr buenas condiciones para este tipo de lesiones, por lo tanto, las estrategias de regeneración basada en células ofrecen una atractiva oportunidad para mejorar los resultados y reducir una nueva lesión.
En la mayoría de estudios de 5 – 20 millones de BMMSC autólogo se inyectan directamente en la lesión que por lo general se produce dentro del núcleo del cuerpo del tendón que por lo tanto actúa como un receptáculo para las células. El destino de las células una vez inyectadas no es métodos claros y distintos etiquetado celular para rastrear las células se han descrito recientemente. Las células marcadas con una etiqueta de fluorescencia, se mostró a sobrevivir sólo en un número relativamente pequeño (<10%) 10,11. Etiquetas de fluorescencia requierenla extracción de tejidos y seccionamiento para el análisis histológico, que es mucho tiempo y no facilita fácilmente análisis temporal en un modelo animal de gran tamaño o en casos clínicos. En un trabajo más reciente se ha utilizado el 99m Tc radioisótopos para etiquetar células y seguir su destino por gamma gammagrafía 1. Este método permite comparaciones rápidas que se hagan entre las diferentes vías de administración de células, incluyendo intralesional, intravenosa a través de la vena yugular 1 o perfusión regional vía intra-arteriales 12 o intravenosos 1,12 inyecciones. La persistencia y la distribución de células pueden obtenerse imágenes por escintigrafía gamma de varios órganos. Esto ha demostrado que sólo el 24% de las células inyectadas intralesional permaneció en la lesión por 24 hr 1 y esto se apoya en otro estudio usando lesiones experimentalmente creados y utilizando el mismo marcador radiactivo 5. Además, las células muestran una capacidad limitada para el hogar en las lesiones del tendón cuando delivered por perfusión regional o por vía intravenosa, pero se dispersan en los pulmones por los últimos 4 rutas.
BMMSC marcado con nanopartículas de hierro es un método alternativo para realizar un seguimiento de las células implantadas en los tendones de las extremidades anteriores 13. Aunque las células marcadas de nanopartículas de hierro permiten el seguimiento de células in vivo por resonancia magnética, los estudios temporales en un animal grande están limitadas por el número de veces que la anestesia se pueden administrar en cada punto de tiempo para la realización de las exploraciones de MRI. Además, las nanopartículas de hierro son hipointensa en la RM que limita la información sobre la migración de células marcadas en el cuerpo del tendón. Otros radioisótopos que se pueden utilizar incluyen indio-111, pero esto tiene la desventaja de una semivida más larga que Tc-99m (2,8 días vs 6,0 hr) y mayor energía de emisión de rayos gamma. Además, la viabilidad celular se ha informado de que se reduce cuando marcado con indio-111 14. Tc-99m, por otro lado, se utiliza rutinariamente en tanto nuclear equina y humanamedicina para marcar las células mononucleares de sangre periférica y sigue su distribución in vivo mediante gammagrafía. Puede ser relativamente fácil captado por las células utilizando HMPAO como una molécula de enlazador para unir el tecnecio, como Tc-99m-HMPAO, a las células. Tc-99m-HMPAO etiquetado BMMSC mostrar buena viabilidad y puede proliferar in vitro 4. Este protocolo se detalla el etiquetado y el seguimiento de BMMSC autólogo equina implantado en las lesiones que ocurren naturalmente en el TFDS extremidad anterior.
Es importante tener en cuenta que el protocolo está solamente destinado a ser utilizado como una herramienta de investigación. Su uso como una modalidad terapéutica clínica no se recomienda como el efecto de la radiomarcador en el fenotipo celular no ha sido totalmente dilucidado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Además de la médula ósea, las células madre aisladas a partir de fuentes tales como el tejido adiposo son adecuados para el etiquetado con este protocolo. Además, las células de un estado congelado pueden ser revividos y se expandieron en cultivo para los números deseados para los estudios de etiquetado 12.
Un factor crítico que determina la eficiencia de marcaje del BMMSC es el tiempo entre la elución de la Tc-99m desde el generador de molibdeno en la radiofarmacia, la p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge funding from the Horserace Betting Levy Board U.K. (grant number 721) and VetCell BioScience Ltd, U.K. and by Consejerìa de Innovaciòn, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucìa, Spain.
Materials
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 h of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec – Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18G and 19G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18G); NN1938R (19G) | |
| Syringes 1 mL and 2 mL | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 mL); SYR6003 (2 mL) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
References
- Becerra, P., et al. Distribution of injected technetium(99m)-labeled mesenchymal stem cells in horses with naturally occurring tendinopathy. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1096-1102 (2013).
- Nixon, A. J., Dahlgren, L. A., Haupt, J. L., Yeager, A. E., Ward, D. L. Effect of adipose-derived nucleated cell fractions on tendon repair in horses with collagenase-induced tendinitis. American Journal of Veterinary Research. 69, 928-937 (2008).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1392-1398 (2009).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PloS one. 8, e75697 (2013).
- Sole, A., et al. Distribution and persistence of technetium-99 hexamethyl propylene amine oxime-labelled bone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimentally induced tendon lesions after intratendinous injection and regional perfusion of the equine distal limb. Equine Veterinary Journal. 45, 726-731 (2013).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 44, 25-32 (2012).
- Crevier-Denoix, N., et al. Mechanical properties of pathological equine superficial digital flexor tendons. Equine Veterinary Journal. 29, 23-26 (1997).
- O’Meara, B., Bladon, B., Parkin, T. D., Fraser, B., Lischer, C. J. An investigation of the relationship between race performance and superficial digital flexor tendonitis in the Thoroughbred racehorse. Equine Veterinary Journal. 42, 322-326 (2010).
- Alexander, R. M. Energy-saving mechanisms in walking and running. The Journal of Experimental Biology. 160, 55-69 (1991).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Monitoring the fate of autologous and allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: preliminary study. Equine Veterinary Journal. 40, 178-181 (2008).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Equine embryonic stem-like cells and mesenchymal stromal cells have different survival rates and migration patterns following their injection into damaged superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 42, 636-642 (2010).
- Sole, A., et al. Scintigraphic evaluation of intra-arterial and intravenous regional limb perfusion of allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the normal equine distal limb using (99m) Tc-HMPAO. Equine Veterinary Journal. 44, 594-599 (2012).
- Carvalho, A. M., et al. Evaluation of mesenchymal stem cell migration after equine tendonitis therapy. Equine Veterinary Journal. 46, 635-638 (2014).
- Welling, M. M., Duijvestein, M., Signore, A., van der Weerd, L. In vivo biodistribution of stem cells using molecular nuclear medicine imaging. Journal of Cellular Physiology. 226, 1444-1452 (2011).
- Dowling, B. A., Dart, A. J., Hodgson, D. R., Smith, R. K. Superficial digital flexor tendonitis in the horse. Equine Veterinary Journal. 32, 369-378 (2000).
- Kasashima, Y., Ueno, T., Tomita, A., Goodship, A. E., Smith, R. K. Optimisation of bone marrow aspiration from the equine sternum for the safe recovery of mesenchymal stem cells. Equine Veterinary Journal. 43, 288-294 (2011).
- Avella, C. S., et al. Ultrasonographic assessment of the superficial digital flexor tendons of National Hunt racehorses in training over two racing seasons. Equine Veterinary Journal. 41, 449-454 (2009).
- de Vries, E. F., Roca, M., Jamar, F., Israel, O., Signore, A. Guidelines for the labelling of leucocytes with (99m)Tc-HMPAO. Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 37, 842-848 (2010).
- Trela, J. M., et al. Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot. Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).
- Barbash, I. M., et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation. 108, 863-868 (2003).
- Heckl, S. Future contrast agents for molecular imaging in stroke. Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).
