Vi beskriver en metode til generering af in vitro-afledte mastceller, deres engraftment i mastcelle-mangelfulde mus og analyse af fænotypen, antal og fordeling af engrafterede mastceller på forskellige anatomiske steder. Denne protokol kan bruges til at vurdere mastcellernes funktioner in vivo.
Mastceller (MCs) er hæmatopoietiske celler, der findes i forskellige væv, og er især rigelige på steder, der udsættes for det ydre miljø, såsom hud, luftveje og mave-tarmkanalen. Bedst kendt for deres skadelige rolle i IgE-afhængige allergiske reaktioner, har MCs også vist sig som vigtige aktører i værtsforsvaret mod gift og invaderende bakterier og parasitter. MC-fænotype og -funktion kan påvirkes af mikromiljøfaktorer, der kan variere afhængigt af anatomisk placering og/eller baseret på typen eller udviklingsstadiet for immunrespons. Af denne grund har vi og andre begunstiget in vivo tilgange over in vitro metoder til at få indsigt i MC funktioner. Her beskriver vi metoder til generering af mus knoglemarvs-afledte dyrkede MC’er (BMCMCs), deres adoptivoverførsel til genetisk MC-mangelfuld mus, og analysen af antallet og fordelingen af adoptiv-overførte MC’er på forskellige anatomiske steder. Denne metode, der kaldes“mast celle knock-in”-metoden, er blevet anvendt i vid udstrækning i løbet af de sidste 30 år til at vurdere MCs og MC-afledte produkter in vivo. Vi diskuterer fordele og begrænsninger ved denne metode i lyset af alternative tilgange, der er blevet udviklet i de senere år.
Mastceller (MCs) er hæmatopoietiske celler, der opstår fra pluripotente knoglemarvs forfædre1-3. Efter knoglemarvsudstridelse migrerer MCs-forfædre ind i forskellige væv, hvor de udvikler sig til modne MCs under indflydelse af lokale vækstfaktorer1-3. Vævsbeboende MCs er strategisk placeret på værtsmiljøgrænseflader, såsom huden, luftvejene og mave-tarmkanalen, hvor de opfører sig som en første forsvarslinje mod eksterne fornærmelser3-6. MCs er ofte subklassificeret baseret på deres “baseline” fænotypiske egenskaber og deres anatomiske placeringer. Hos mus er der beskrevet to typer MC’er: “bindevævstype” MCs (CTMCs) og slimhinde-MCs (MMCs)1-3,7,8. CTMCs er ofte placeret omkring venules og nær nervefibre, og bor i serosale hulrum, mens MMCs indtager intraepithelial steder i tarmen og respiratorisk slimhinde1-3.
Talrige metoder er blevet anvendt til at studere biologiske funktioner af MCs9-13. Mange grupper har fokuseret på in vitro tilgange ved hjælp af enten cellelinjer (såsom den menneskelige MC linjer HMC114 eller LAD215,16), in vitro afledte MC (såsom menneskelige perifere blod-afledte MC17, eller mus knoglemarv-afledt kultur18, føtal hudafledte dyrkede MC’er [FSCMCs]19 og peritoneale cellebaserede MCs [PCMCs]20) eller ex vivo isolerede MCS fra forskellige anatomiske steder. Alle disse modeller er meget udbredt til at studere molekylære detaljer i MC biologi, såsom signalering veje involveret i MC aktivering. Et vigtigt aspekt af MCs biologi er imidlertid, at deres fænotypiske og funktionelle egenskaber(f.eks.cytoplasmisk granulatproteaseindhold eller reaktion på forskellige stimuli) kan moduleres ved anatomisk placering og mikromiljø2,7. Da den nøjagtige blanding af sådanne faktorer, der opstår in vivo, kan være vanskelig at reproducere in vitro, går vi ind for at bruge in vivo-tilgange til at få indsigt i MCs-funktioner9.
Der findes flere musestammer med genetisk MC-mangel, såsom de udbredte WBB6F1–Kit W/W-v eller C57BL/6-Kit W-sh/W-sh mus. Disse mus mangler udtryk og/eller aktivitet af KIT (CD117), receptoren for den vigtigste MC vækstfaktor stamcellefaktor (SCF)21,22. Som følge heraf har disse mus en dyb MC-mangel, men har også yderligere fænotypiske abnormiteter relateret til deres c- kit-mutationer (i WBB6F1–Kit W/ W-v mus) eller til virkningerne af den store kromosomale inversion, der resulterer i reduceret c-kit-udtryk (i C57BL/6-Kit W-sh/W-sh mus) 9,10,12,23. For nylig er flere stammer af mus med c-kit-uafhængigkonstituerende MC-mangel blevet rapporteret24-26. Alle disse mus og nogle yderligere nye typer af inducible MC-mangelfulde mus er for nylig blevet gennemgået i detaljer9,10,13.
Her beskriver vi metoder til generering af mus knoglemarv-afledte dyrkede MC’er (BMCMCs), deres adoptivoverførsel til MC-mangelfuld mus, og analysen af antallet og fordelingen af adoptiv-overførte MC’er på forskellige anatomiske steder. Denne såkaldte “mastcelle knock-in”-metode kan bruges til at vurdere MCs og MC-afledte produkter in vivo. Vi diskuterer fordele og begrænsninger ved denne metode i lyset af alternative tilgange, der er blevet udviklet i de senere år.
Næsten 30 år efter den første beskrivelse38, den ‘mast celle knock-in‘ tilgang fortsætter med at give værdifulde oplysninger om, hvad MCs kan gøre eller ikke kan gøre in vivo. De funktioner, MCs var længe menes at være begrænset til deres rolle i allergi. Data genereret ved hjælp af ‘mast celle knock-in‘ tilgang har ændret denne opfattelse, ved at fremlægge bevis for, at MCs kan blandt andre funktioner, spille kritiske roller i værtsforsvaret mod visse patogener4,3…
The authors have nothing to disclose.
N.G. modtager stipendier fra den franske “Fondation pour la Recherche Médicale FRM” og Philipp Foundation; R.S. støttes af Lucile Packard Foundation for Children’s Health og Stanford NIH/NCRR CTSA award number UL1 RR025744; PS støttes af et Max Kade Fellowship fra Max Kade Foundation og det østrigske videnskabsakademi og et Schroedinger Fellowship fra den østrigske videnskabsfond (FWF): J3399-B21; SJ G. anerkender støtte fra National Institutes of Health tilskud U19 AI104209, NS 080062 og fra Tobaksrelaterede Sygdomme Research Program ved University of California; L.L.R. anerkender støtte fra Arthritis National Research Foundation (ANRF) og National Institutes of Health grant K99AI110645.
1% Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning cellgro | 30-004-Cl | |
3 ml Syringe | Falcon | 309656 | |
35 mm x 10 mm Dish | Corning cellgro | 430588 | |
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | 352058 | |
Acetic Acid Glacial | Fisher Scientific | A35-500 | |
Alcian Blue 8GX | Rowley Biochemical Danver | 33864-99-2 | |
Allegra 6R Centrifuge | Beckman | ||
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified | eBioscience | 14-0161-81 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M7522 | |
BD 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles | BD Precision Glide Needle | 205155 | |
BD 25G 5/8 Needles | BD Syringe | 305122 | |
BD 30G x1/2 Needles | BD Precision Glide | 305106 | |
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352097 | |
Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
Cytoseal 60 Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
Cytospin3 | Shandon | NA | |
DakoCytomation pen | Dako | S2002 | |
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Corning cellgro | 15-013-CM | |
Ethanol | Sigma Aldrich | E 7023-500ml | |
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma Aldrich | F4135-500ml | |
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control | eBioscience | 14-4031-82 | |
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) | eBioscience | 11-1171-82 | |
Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
Giemsa Stain Modified | Sigma Aldrich | GS-1L | |
Isothesia | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
May-Grunwald Stain | Sigma Aldrich | MG-1L | |
Multiwell 6 well plates | Falcon | 35 3046 | |
Olympus BX60 Microscope | Olympus | NA | |
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium | Fisher Brand | 23-021-400 | |
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control | eBioscience | 12-4888-81 | |
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x | Corning cellgro | 21-040-CV | |
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) | eBioscience | 12-5898-82 | |
Propidium Iodide Staining Solution | eBioscience | 00-6990-50 | |
Recombinant Mouse IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
Safranin-o Certified | Sigma Aldrich | S8884 | |
Tissue culture flasks T25 25 cm2 | Beckton Dickinson | 353109 | |
Tissue culture flasks T75 75 cm2 | Beckton Dickinson | 353110 | |
Toluidine Blue 1 % Aqueous | LabChem-Inc | LC26165-2 | |
Recombinant Mouse SCF | Peprotech | 250-03 |