Analisi delle funzioni delle mastociti in vivo usando topi ' Mast Cell Knock-in'

Summary

Descriviamo un metodo per la generazione di mastociti derivate in vitro, il loro innesto in topi carenti di mastociti, e l’analisi del fenotipo, dei numeri e della distribuzione delle mastociti innestati in diversi siti anatomici. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare le funzioni delle mastociti in vivo.

Abstract

Le mastociti (MC) sono cellule ematopoietiche che risiedono in vari tessuti e sono particolarmente abbondanti in siti esposti all’ambiente esterno, come la pelle, le vie aeree e il tratto gastrointestinale. Meglio noti per il loro ruolo dannoso nelle reazioni allergiche dipendenti dall’IgE, i MC sono anche emersi come attori importanti nella difesa dell’ospite contro il veleno e invadendo batteri e parassiti. Il fenotipo e la funzione MC possono essere influenzati da fattori microambientali che possono differire a seconda della posizione anatomica e/o in base al tipo o allo stadio di sviluppo delle risposte immunitarie. Per questo motivo, noi e altri abbiamo favorito approcci in vivo rispetto ai metodi in vitro per ottenere informazioni sulle funzioni MC. Qui descriviamo i metodi per la generazione di MC coltivati derivati dal midollo osseo del topo (BCMCC), il loro trasferimento adottivo in topi geneticamente carenti di MC e l’analisi del numero e della distribuzione di MC trasferiti adottivamente in diversi siti anatomici. Questo metodo, chiamato approccio“mast cell knock-in”, è stato ampiamente utilizzato negli ultimi 30 anni per valutare le funzioni dei MC e dei prodotti derivati da MC in vivo. Discutiamo dei vantaggi e dei limiti di questo metodo, alla luce degli approcci alternativi sviluppati negli ultimi anni.

Introduction

Le mastociti (MC) sono cellule ematopoietiche che derivano da progenitori pluripotenti del midollo^{osseo 1-3}. A seguito dell’egressione del midollo osseo, i progenitori di MC migrano in vari tessuti dove si sviluppano in MC maturi sotto l’influenza di fattori di^{crescita locali 1-3}. I MC residenti nei tessuti si trovano strategicamente nelle interfacce host-ambiente, come la pelle, le vie aeree e il tratto gastrointestinale, dove si comportano come una prima linea di difesa contro gli insulti^{esterni 3-6}. I MC sono spesso sottoclassificato in base alle loro caratteristiche fenotipiche “basale” e alle loro posizioni anatomiche. Nei topi sono stati descritti due tipi di TC: I MAT (CTMC) di tipo tessuto connettivo e i MC mucosi (MMC)^1-3,7,8. I CTMC si trovano spesso intorno alle vene e vicino alle fibre nervose e risiedono in cavità sierosali, mentre gli MLC occupano posizioni intraepiteliali nell’intestino e nella mucosa^{respiratoria 1-3}.

Numerose metodologie sono state applicate per studiare le funzioni biologiche dei MC^9-13. Molti gruppi si sono concentrati su approcci in vitro utilizzando linee cellulari (come le linee MC umane HMC1¹⁴ o LAD2^15,16),MC derivati in vitro (come MC¹⁷derivati dal sangue periferici umani o derivati dal midollo osseo del topo MC coltivati [BCMCC]¹⁸, MC coltivati derivati dalla pelle fetale [FCMCC]¹⁹ e MC peritoneali derivati da cellule [PCPC]²⁰) o MC isolati ex vivo provenienti da diversi siti anatomici. Tutti questi modelli sono ampiamente utilizzati per studiare i dettagli molecolari della biologia MC, come le vie di segnalazione coinvolte nell’attivazione MC. Tuttavia, un aspetto importante della biologia delle CCI è che le loro caratteristiche fenotipiche e funzionali(ad esempio,contenuto di proteasi del granulo citoplasmatico o risposta a diversi stimoli) possono essere modulate dalla posizione anatomica e dal microambiente^2,7. Poiché l’esatta miscela di tali fattori che si incontrano in vivo può essere difficile da riprodurre in vitro,favoriamo l’utilizzo di approcci in vivo per ottenere informazioni sulle funzioni^{9 delle TC.}

Esistono diversi ceppi di topi con carenza genetica di MC, come i topi WBB6F₁–Kit ^W/W-v o C57BL/6-Kit ^W-sh/W-sh. Questi topi mancano di espressione e/o attività di KIT (CD117), il recettore per il principale fattore di crescita MC fattore di crescita fattore di cellule staminali (SCF)^21,22. Di conseguenza, questi topi hanno una profonda carenza di MC ma hanno anche anomalie fenotipiche aggiuntive legate alle loro mutazioni delkit c- (nei topi WBB6F₁–Kit ^W/W-v) o agli effetti della grande inversione cromosomica che si traduce in una ridotta espressione delkit c- (nei topi C57BL/6-Kit ^{W-sh/W-sh) 9,10,12,23}. Più recentemente, diversi ceppi di topi con carenza di MC costitutiva indipendente dalkitc- sono stati segnalati^24-26. Tutti questi topi e alcuni nuovi tipi aggiuntivi di topi inducibili a disinvolto mc sono stati recentemente esaminati in^{dettaglio 9,10,13}.

Qui descriviamo i metodi per la generazione di MC coltivati derivati dal midollo osseo del topo (BBMCMC), il loro trasferimento adottivo in topi a disacienti mc e l’analisi del numero e della distribuzione di MC trasferiti adottivamente in diversi siti anatomici. Questo cosiddetto metodo “mast cell knock-in” può essere utilizzato per valutare le funzioni dei MC e dei prodotti derivati da MC in vivo. Discutiamo dei vantaggi e dei limiti di questo metodo, alla luce degli approcci alternativi sviluppati negli ultimi anni.

Protocol

Tutta la cura e la sperimentazione degli animali sono state condotte nel rispetto delle linee guida dei National Institutes of Health e con l’approvazione specifica dell’Institutional Animal Care and Use Committee della Stanford University. 1. Generazione e caratterizzazione di mastociti coltivati derivati dal midollo osseo (BBMCMC). Nota: I BBMCMC donatori devono essere generati da cellule del midollo osseo dello stesso background genetico dei topi riceventi carenti …

Representative Results

Una panoramica dell’approccio “mast cell knock-in” è mostrata nella Figura 1, e include la generazione di BBMCC, il numero di cellule che dovrebbero essere innestati i.p., i.d. o i.v. in topi mc-carenti (il numero può essere variato se indicato in base al progetto sperimentale) e l’intervallo tra l’innesto e l’esperimento a seconda del sito di iniezione (anche questo intervallo può variare, se indicato; ad esempio, ilcontenuto di mediatori immagazzinati nei granuli citoplasmatici MC …

Discussion

Quasi 30 anni dopo la sua descrizione^{iniziale 38,}l’approccio‘mast cell knock-in’continua a fornire preziose informazioni su ciò che i PC possono fare o non possono fare in vivo. Si pensava che le funzioni dei TC fossero limitate al loro ruolo nell’allergia. I dati generati utilizzando l’approccio “mast cell knock-in” hanno cambiato questa visione, fornendo prove che i MC possono, tra le altre funzioni, svolgere ruoli critici nella difesa dell’ospite^{contro alcuni agenti patogeni…}

Materials

1% Antibiotic-Antimycotic Solution	Corning cellgro	30-004-Cl
3 ml Syringe	Falcon	309656
35 mm x 10 mm Dish	Corning cellgro	430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube	Falcon	352058
Acetic Acid Glacial	Fisher Scientific	A35-500
Alcian Blue 8GX	Rowley Biochemical Danver	33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge	Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified	eBioscience	14-0161-81
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M7522
BD 1 ml TB Syringe	BD Syringe	309659
BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles	BD Precision Glide Needle	205155
BD 25G 5/8 Needles	BD Syringe	305122
BD 30G x1/2 Needles	BD Precision Glide	305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube	Falcon	352097
Chloroform	Fisher Scientific	C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium	Richard-Allan Scientific	8310-4
Cytospin3	Shandon	NA
DakoCytomation pen	Dako	S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x	Corning cellgro	15-013-CM
Ethanol	Sigma Aldrich	E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated	Sigma Aldrich	F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control	eBioscience	14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)	eBioscience	11-1171-82
Formaldehyde	Fisher Scientific	F79-500
Giemsa Stain Modified	Sigma Aldrich	GS-1L
Isothesia	Henry Schein Animal Health	29405
May-Grunwald Stain	Sigma Aldrich	MG-1L
Multiwell 6 well plates	Falcon	35 3046
Olympus BX60 Microscope	Olympus	NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium	Fisher Brand	23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control	eBioscience	12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x	Corning cellgro	21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)	eBioscience	12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution	eBioscience	00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3	Peprotech	213-13
Safranin-o Certified	Sigma Aldrich	S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2	Beckton Dickinson	353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2	Beckton Dickinson	353110
Toluidine Blue 1 % Aqueous	LabChem-Inc	LC26165-2
Recombinant Mouse SCF	Peprotech	250-03