Vi beskriver en metod för generering av in vitro härledda mastceller, deras engraftment i mast cell-bristfälliga möss och analysen av fenotyp, siffror och fördelning av ingrafted mastceller på olika anatomiska platser. Detta protokoll kan användas för att bedöma funktionerna i mastceller in vivo.
Mastceller (MCs) är hematopoetiska celler som finns i olika vävnader, och är särskilt rikliga på platser som utsätts för den yttre miljön, såsom hud, luftvägar och mag-tarmkanalen. Mest kända för sin skadliga roll i IgE-beroende allergiska reaktioner har MCs också dykt upp som viktiga aktörer i värdförsvar mot gift och invaderande bakterier och parasiter. MC fenotyp och funktion kan påverkas av mikromiljömentala faktorer som kan skilja sig åt beroende på anatomisk plats och/eller baserat på typ eller utvecklingsstadium för immunsvar. Av denna anledning har vi och andra gynnat in vivo-metoder framför in vitro-metoder för att få insikt i MC-funktioner. Här beskriver vi metoder för generering av mus benmärg-härledda odlade MCs (BMCMCs), deras adoptivöverföring till genetiskt MC-bristfälliga möss och analysen av antalet och fördelningen av adoptivt överförda MCs på olika anatomiska platser. Denna metod, som kallas“mastcells-knock-in”-metoden, har använts i stor utsträckning under de senaste 30 åren för att bedöma funktionerna hos MCs och MC-härledda produkter in vivo. Vi diskuterar fördelarna och begränsningarna med denna metod, mot bakgrund av alternativa tillvägagångssätt som har utvecklats under de senaste åren.
Mastceller (MCs) är hematopoetiska celler som uppstår från pluripotenta benmärgsprogenitorer1-3. Efter benmärgsegression migrerar MCs-stamceller till olika vävnader där de utvecklas till mogna MCs under påverkan av lokalatillväxtfaktorer 1-3. Vävnadsboende MCs är strategiskt placerade vid värdmiljögränssnitt, såsom huden, luftvägarna och mag-tarmkanalen, där de beter sig som en första försvarslinje mot yttreförolämpningar 3-6. MCs är ofta sub-classified baserat på deras “baslinje” fenotypiska egenskaper och deras funktionella platser. Hos möss har två typer av MCs beskrivits: MCs av “bindvävstyp” (CTMCs) och MCs (MCosal MCs)1-3,7,8. CTMCs ligger ofta runt venuler och nära nervfibrer, och bor i serosala håligheter, medan MMCs upptar intraepithelial platser i tarmen och andningsslemhinnan1-3.
Många metoder har tillämpats för att studera biologiska funktioner hos MCs9-13. Många grupper har fokuserat på in vitro-metoder med hjälp av antingen cellinjer (t.ex. de mänskliga MC-linjerna HMC114 eller LAD215,16), in vitro-härledda MCs (t.ex. humana perifera blodbaserade MCs17, eller musbenmärgs-härledda MCs odlade MCs [BMCMCs]18,fetala hud-härledda odlade MCs [FSCMCs]19 och peritoneal cell-härledda MCs [PCMCs]20) eller ex vivo isolerade MCs från olika anatomiska platser. Alla dessa modeller används ofta för att studera molekylära detaljer i MC-biologi, såsom signalvägar som är involverade i MC-aktivering. En viktig aspekt av MCs biologi är dock att deras fenotypiska och funktionella egenskaper(t.ex.cytoplasmic granulat proteas innehåll eller svar på olika stimuli) kan moduleras genom anatomisk plats och mikromiljö2,7. Eftersom den exakta blandningen av sådana faktorer som uppstår in vivo kan vara svår att reproducera in vitro, föredrar vi att använda in vivo-metoder för att få insikter i MCs-funktioner9.
Flera musstammar med genetisk MC-brist finns, såsom de allmänt använda WBB6F1–Kit W/ W-v eller C57BL / 6 –Kit W-sh / W-sh möss. Dessa möss saknar uttryck och/eller aktivitet av KIT (CD117), receptorn för den viktigaste MC-tillväxtfaktorn stamcellsfaktor (SCF)21,22. Som ett resultat har dessa möss en djupgående MC-brist men har också ytterligare fenotypiska avvikelser relaterade till deras c-kit mutationer (i WBB6F1–Kit W / W-v möss) eller effekterna av den stora kromosomal inversion som resulterar i minskad c-kit uttryck (i C57BL/6-Kit W-sh/W-sh möss)9,10,12,23. På senare tid har flera stammar av möss med c-kit-oberoende konstituerande MC-brist rapporterats24-26. Alla dessa möss och några ytterligare nya typer av inducerbara MC-bristfälliga möss har nyligen granskats i detalj9,10,13.
Här beskriver vi metoder för generering av mus benmärg-härledda odlade MCs (BMCMCs), deras adoptivöverföring till MC-bristfälliga möss och analysen av antalet och fördelningen av adoptiviskt överförda MCs på olika anatomiska platser. Denna så kallade “mastcellsknackning” -metod kan användas för att bedöma funktionerna hos MCs och MC-härledda produkter in vivo. Vi diskuterar fördelarna och begränsningarna med denna metod, mot bakgrund av alternativa tillvägagångssätt som har utvecklats under de senaste åren.
Nästan 30 år efter den förstabeskrivningen 38fortsätter metoden med” mastcellsknackning” att ge värdefull information om vad MCs kan göra eller inte kan göra in vivo. Funktionerna hos MCs ansågs länge vara begränsade till deras roll i allergi. Data som genereras medhjälp av metoden ” mastcellsknackning” har ändrat denna uppfattning genom att tillhandahålla bevis för att MCs bland annat kan spela kritiska roller i värdförsvaret mot vissapatogener 4,39 eller<…
The authors have nothing to disclose.
N.G. är mottagare av stipendier från franska “Fondation pour la Recherche Médicale FRM” och Philipp Foundation; R.S. stöds av Lucile Packard Foundation for Children’s Health och Stanford NIH/NCRR CTSA award number UL1 RR025744; P.S. stöds av max Kade-stipendiet från Max Kade-stiftelsen och den österrikiska vetenskapsakademin och ett Schroedinger-stipendium från Österrikiska vetenskapsfonden (FWF): J3399-B21; S.J.G. erkänner stöd från National Institutes of Health-bidrag U19 AI104209, NS 080062 och från Tobacco-Related Disease Research Program vid University of California; L.L.R. erkänner stöd från Arthritis National Research Foundation (ANRF) och National Institutes of Health grant K99AI110645.
1% Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning cellgro | 30-004-Cl | |
3 ml Syringe | Falcon | 309656 | |
35 mm x 10 mm Dish | Corning cellgro | 430588 | |
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | 352058 | |
Acetic Acid Glacial | Fisher Scientific | A35-500 | |
Alcian Blue 8GX | Rowley Biochemical Danver | 33864-99-2 | |
Allegra 6R Centrifuge | Beckman | ||
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified | eBioscience | 14-0161-81 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M7522 | |
BD 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles | BD Precision Glide Needle | 205155 | |
BD 25G 5/8 Needles | BD Syringe | 305122 | |
BD 30G x1/2 Needles | BD Precision Glide | 305106 | |
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352097 | |
Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
Cytoseal 60 Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
Cytospin3 | Shandon | NA | |
DakoCytomation pen | Dako | S2002 | |
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Corning cellgro | 15-013-CM | |
Ethanol | Sigma Aldrich | E 7023-500ml | |
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma Aldrich | F4135-500ml | |
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control | eBioscience | 14-4031-82 | |
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) | eBioscience | 11-1171-82 | |
Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
Giemsa Stain Modified | Sigma Aldrich | GS-1L | |
Isothesia | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
May-Grunwald Stain | Sigma Aldrich | MG-1L | |
Multiwell 6 well plates | Falcon | 35 3046 | |
Olympus BX60 Microscope | Olympus | NA | |
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium | Fisher Brand | 23-021-400 | |
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control | eBioscience | 12-4888-81 | |
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x | Corning cellgro | 21-040-CV | |
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) | eBioscience | 12-5898-82 | |
Propidium Iodide Staining Solution | eBioscience | 00-6990-50 | |
Recombinant Mouse IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
Safranin-o Certified | Sigma Aldrich | S8884 | |
Tissue culture flasks T25 25 cm2 | Beckton Dickinson | 353109 | |
Tissue culture flasks T75 75 cm2 | Beckton Dickinson | 353110 | |
Toluidine Blue 1 % Aqueous | LabChem-Inc | LC26165-2 | |
Recombinant Mouse SCF | Peprotech | 250-03 |