Användning av Teton system att studera molekylära mekanismer Zebrafish Regeneration

Summary

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Abstract

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta–catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Introduction

Den zebrafisk är en väletablerad ryggradsdjur modellorganism för att studera många aspekter av utveckling, fysiologi, sjukdomar och förnyelse. Med den växande antagandet av zebrafisk som en modell för post-embryonala biologiska processer, experimentella verktyg för inducerbar, vävnadsspecifik manipulering av genuttryck eller signalvägar har blivit allt viktigare. I synnerhet har studier i orgel och bihang förnyelse i vuxen zebrafisk lidit av en brist på verktyg för dissekering av de spatio-temporala krav på signalvägar under dessa regenerativa processer.

För närvarande har tre olika system använts för att åstadkomma villkorlig, vävnadsspecifik genexpression i regenererande organ av vuxna zebrafisk: Cre-lox-systemet, mosaik uttryck av värmechocks inducerbara transgener med användning av transposon-medierad somatisk transgenes, och Teton systemet ^{1 -3.} Teton avser en variant av en tetracyklin-kontrullade aktiveringssystem transkriptionell, där uttryckning aktiveras i närvaro av antibiotikumet tetracyklin eller ett derivat, t ex doxycyklin. Cre-lox-systemet, eftersom det hittills använts i vuxen fisk, bygger på en Tamoxifen styrd Cre rekombinas (CreERT2), vars uttryck är rumsligt begränsad av vävnadsspecifika regulatoriska element. Cre-driven avlägsnande av en STOP-kassett underlättar expression av genen av intresse driven av en promotor som ska vara aktiv i alla celltyper ^1. Transposon-medierad skapa mosaically uttryckta somatiska transgener tillhandahåller ett system för inducerbar transgenexpression i enskilda cellinjer. Injektion av zebrafiskembryon med Tol2 transposon bär en gen av intresse under transkriptionskontroll av en värmechockspromotorresulterar i chimära individer typiskt bär transgenen endast i diskreta cell linjer av en regenererande organet ^2. Även om båda systemen tillåter villkorlig vävnads specifik genuttryck är Cre-lox systemet inte reversibel, och strategin med hjälp av transposon-baserade klonal märkning lider av sin stokastiska natur. Alltså, vi och andra har nyligen anpassat transgena Teton system för användning i zebrafisk, som underlättar temporärt och spatialt kontrollerad genuttryck som är ett tillägg avstämbar och reversibel ^3-5.

Teton system som används här innefattar en transgen föraruppställning (TetActivator) i vilken en Doxycyklin (DOX) -inducerbara transkriptionsaktivator (förbättrad omvänd tetracyklin trans, irtTA, kort Teta) står under kontroll av vävnadsspecifika iska regulatoriska sekvenser. För det andra krävs det en transgen responder linje (TetResponder) som hyser en gen av intresse under transkriptionskontroll av Tetracyklin operatören (Tet svarselementet; Tetre) (Figur 1A). Således, användning av specifika kombinationer av TetActivator och TetResponder linjer möjliggör villkorvävnadsspecifikafic manipulering av genuttryck.

Vi har nyligen utnyttjat Teton systemet att söka för vävnadsspecifika funktioner Wnt / beta-catenin signalering i vuxen regenererande zebrafisk stjärtfenan ^3. I det protokoll som beskrivs här beskriver vi ett arbetsflöde för installation och användning av Teton systemet zebrafisk, särskilt när det gäller studier av fin förnyelse. Detta inkluderar detaljerade instruktioner om hur man skapar stabila transgena TetActivator och TetResponder linjer och ett protokoll för transgen induktion hos embryon och vuxna zebrafisk. Dessutom beskriver vi metoder för verifiering av vävnadsspecifika genuttryck i fin pånyttfödda, inklusive ett protokoll för framställning av kryosnitt av vuxna zebrafisk fenor. Dessutom diskuterar vi överväganden för utformningen av TetActivator transgenen, valet av en transgenes metod, och detektion av TetResponder uttryckning. Därför är det övergripande målet med detta protokoll att fungera som en blåkopiaför att inrätta en funktionell teton system zebrafisk att uppnå villkorlig vävnadsspecifik genexpression, som kan tillämpas på alla vävnader av intresse.

Vi har skapat en TetActivator vektor medger I-SCEI eller Tol2-medierad generation stabila TetActivator linjer med korta genomiska regulatoriska sekvenser (förstärkare fragment, Weidinger lab plasmid databas nr 1247;. Figur 1B). Denna konstruktion innehåller en TetActivator kassett bestående av M2 muterade varianten av den omvända Tet repressordomänen smält med Herpes simplex virus VP16 transdomän derivat 3F [irtTAM2 (3F)]. Expression av TetActivator (TETA) kan lätt övervakas eftersom det samuttrycks med fluoroforen AmCyan från samma öppna läsram; en P2A peptid medierar ribosomalt hoppa, vilket bör leda till produktion av Teta och AmCyan som separata proteiner vid en 1: 1-förhållande ^5,6. Konstruktet innehåller också en poylinker 5 'av TetActivator kassett för att underlätta insättning av genomiska regulatoriska sekvenser av intresse med användning av konventionella kloningsmetoder.

Dessutom har vi skapat en konstruktion bestående av ovan beskrivna TetActivator kassett plus en kanamycinselektion kassett (Weidinger lab plasmid databas nr 1180, Fig. 1C), som kan rekombineras i en bakteriell artificiell kromosom (BAC) som innehåller en stor genomregion ( vanligen i startkodonet i en gen vars uttrycksmönster skall imiteras av transgenen). Båda konstruktioner är tillgängliga från Weidinger labbet på begäran.

Protocol

1. Framställning av transgena TetActivator Fish Lines Generation av TetActivator konstruktion Clone regulatoriska sekvenser av intresse uppströms om TetActivator kassetten i vektor # 1247 med användning av standardtekniker. Alternativt kan du använda rekombinationstekniker för att generera en BAC, i vilken TetActivator kassetten (vektor # 1180) införs i det första exonet av målgenen, och där Tol2 inverterade upprepningar införs i BAC huvudkedjan (för en detaljerad recombineering protokoll …

Representative Results

Att etablera en fungerande Teton system för vävnadsspecifika inducerbar genuttryck, transgena TetActivator och TetResponder linjer måste genereras (Figur 1A). Detta åstadkommes genom microinjecting TetActivator (Figur 1B – C) eller TetResponder (figur 1E) konstruktioner i tidiga zebrafisk embryon och därpå följande integrering grodden-linje. Funktionella TetActivator konstruktioner kan antingen alstras genom kloning av korta regulatoriska sekvens…

Discussion

Den vuxna zebrafisk har en fantastisk förmåga att framgångsrikt återskapa många inre organ och bihang. En grundlig förståelse av de molekylära och cellulära mekanismer som är inblandade kräver vävnadsspecifika analys av genfunktioner och signalvägar. Mot detta ger Teton systemet ett effektivt verktyg för spatiotemporally kontrollerad genuttryck i embryonala och vuxna zebrafisk. Teton systemet konstruktioner och metoder som beskrivs i detta manuskript har använts med framgång i en nyligen genomförd studi…

Materials

Breeding boxes	Aqua Schwarz	AquaBox 1
Compound fluorescent microscope	e.g. Leica, Zeiss	varies with the manufacturer	to image fluorescent tissue sections
Confocal microscope	e.g. Leica, Zeiss	varies with the manufacturer	to image fluorescent tissue sections
Cryostat	e.g. Leica, Thermo-Scientific	varies with the manufacturer	for cryosectioning
4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi)	Sigma-Aldrich	D9542	use 1/5000 in PBS for visualization of nuclei
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891	prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction
E3 embryo medium			5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2· 2 H2O, 0.33 mM MgSO4·7 H2O, 0.2 ‰ (w/v) methylene blue, pH 6.5 for embryo/larvae husbandry
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148	4 % (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation
1x Phosphat-buffer saline (PBS)			1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5
1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT)			1x PBS with 0.1 % Tween 20
Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides	Thermo Scientific	1014356190	for collection of tissue sections
Stereo fluorescent microscope	e.g. Leica, Zeiss	varies with the manufacturer	for fluorescence-based genotyping
Thermocycler	e.g. Biorad, Applied Biosystems	varies with the manufacturer	for PCR-based genotyping
Tissue freezing medium (TFM)	Triangel Biomedical Sciences	TFM-C	for embedding of tissue samples
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium