Application de la tache verte de méthyle DNA-spécifique dans le Marquage fluorescent d'embryons

Summary

Une méthode de coloration fluorescente de matériel biologique fixé avec le marquage spécifique de l’ADN vert de méthyle est décrite. Le vert de méthyle est utilisé dans une solution aqueuse diluée et est très résistant au photoblanchiment. Son émission rouge lointain permet d’imager des échantillons en profondeur, ce qui la rend particulièrement adaptée aux embryons entiers.

Abstract

< classe p = 'jove_content'> Le vert de méthyle est connu depuis longtemps comme une coloration histologique avec une affinité spécifique pour l’ADN, bien que ses propriétés fluorescentes soient restées inexplorées jusqu’à récemment. Dans cet article, nous illustrons la méthode de préparation d’une solution mère aqueuse de vert de méthyle qui, une fois diluée, peut être utilisée comme un marqueur nucléaire fluorescent très pratique pour les cellules et les tissus fixés. Des procédures simples pour étiqueter des embryons entiers de poisson-zèbre et de poussin sont détaillées, et des exemples d’images obtenues sont présentés. Le vert de méthyle est excité au maximum par la lumière rouge, à 633 nm, et émet avec un spectre relativement net qui culmine à 677 nm. Il est très peu coûteux, non toxique, très stable en solution et très résistant au photoblanchiment lorsqu’il est lié à l’ADN. Son émission rouge permet une imagerie confocale à balayage haute résolution inaltérée des noyaux dans des échantillons épais. Enfin, ce protocole de coloration au vert de méthyle est compatible avec d’autres procédures de coloration cellulaire, telles que le marquage d’anticorps ou le marquage des filaments d’actine avec de la phalloïdine conjuguée aux fluorophores.

Introduction

La coloration fluorescente de l’ADN est largement et couramment utilisée à la fois dans la recherche biologique et dans le diagnostic clinique, soit pour l’étude détaillée de la structure nucléaire et chromosomique, soit pour la contre-coloration des tissus et des cellules, soit pour l’étude des paramètres du cycle cellulaire¹. Bien que plusieurs colorants d’ADN soient disponibles, les plus largement utilisés ont été ceux excités par la lumière UV et émettant en bleu, qui s’intègrent dans les systèmes à trois filtres habituels utilisés dans la plupart des microscopes à épifluorescence conventionnels lorsqu’ils sont combinés avec des fluorophores émettant du....

Protocol

1. La purification du colorant

1. Préparer une solution aqueuse à 4% de vert de méthyle par dissolution de 0,4 g de poudre de colorant dans 10 ml d'eau distillée. Mélanger soigneusement jusqu'à obtention d'dissoudre.
2. Sous un hottes, mélanger avec au moins 2 parties de chloroforme. Il est important de vérifier au préalable si les tubes sont résistants chloroforme.
3. Mélanger soigneusement et centrifuger pendant 1 min à 2000 xg pour accélérer la séparation de phase.
4. Après centrifugation, une phase supérieure aqueuse avec du vert de méthyle et une phase organique inférieure avec du chloroforme et du cristal violet de conta....

Results

Coloration nucléaire des échantillons épais. Le protocole décrit ici permet la réalisation de coloration homogène de structures profondes dans des embryons entiers. Lentilles développement former des noyaux 48 hpf embryons de poisson zèbre sont étiquetés de façon homogène (figure 1).

Vert de méthyle coloration de l'ADN permet la discrimination des différences morphologiques dépendants du cycle cellulaire tels que l'identification des figures de mitose ou noyaux apoptotiques .......

Discussion

Le développement progressif des techniques de microscopie au cours des dernières décennies, avec un accent particulier sur les variations de la microscopie fluorescente, a conduit à la possibilité d’explorer la dynamique et la structure d’échantillons de tissus intacts, y compris des embryons entiers^10,11. Cependant, l’une des principales limitations a été la disponibilité de fluorophores de bonne qualité qui peuvent être utilisés pour colorer directement et rapidement les structures subcellulaires.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5516
Vert de méthyle	Dr. G. Grü ; bler		a également testé Sigma-Aldrich 323829, qui est sans violet de cristal
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	158127
Microscopie confocale à balayage laser Leica TCS-SP5	Leica Microsystems
Phalloidin&ndash ; Isothiocyanate de tétraméthylrhodamine B	Sigma-Aldrich	P1951  ;
chloroforme	Sigma-Aldrich	372978
Centrifugeuse 5810 R	eppendorf	5811 000.010  ;   ;
lames de microscope	Deltalab	D100004
lamelles Esco	optics	R525025