JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Biologie

Måling af Ekstracellulær ionstrømme Brug af Ion-selektive Self-henvisninger mikroelektrode Teknik

Published: May 03, 2015
doi:
10.3791/52782
, , , ,
1Department of Dermatology, Institute for Regenerative Cures,University of California, Davis, 2Departamento de Biologia, Centro de Biologia Molecular e Ambiental,Universidade do Minho, 3Department of Neurology and Center for Neuroscience,University of California, Davis Imaging of Dementia and Aging Laboratory, 4Department of Ophthalmology, Institute for Regenerative Cures,University of California, Davis

Summary

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Abstract

Celler fra dyr, planter og enkelte celler er omgivet af en barriere kaldet cellemembranen, der adskiller cytoplasmaet udefra. Cellelag såsom epitel også danner en barriere, der adskiller indersiden fra ydersiden eller forskellige rum af flercellede organismer. Et centralt element i disse barrierer er forskellen fordeling af ioner på tværs af cellemembraner eller cellelag. To egenskaber tillader denne fordeling: 1) membraner og epiteler vise selektiv permeabilitet til bestemte ioner; 2) ioner transporteres gennem pumper over cellemembraner og cellelag. Disse egenskaber spiller afgørende roller i at opretholde væv fysiologi og fungere som signalering tidskoder efter skade, under reparation, eller under patologisk tilstand. Den ionselektive selvrefererende mikroelektrode tillader målinger af specifikke fluxe af ioner, såsom calcium, kalium eller natrium ved enkeltcelle-og vævsniveauer. Mikroelektrode indeholder en ionophor cocktail, som erselektivt permeabel for en bestemt ion. Den interne påfyldning opløsning indeholder et sæt koncentration af ionen af ​​interesse. Det elektriske potentiale af mikroelektrode bestemmes af den udvendige koncentration af ionen. Som ionkoncentrationen varierer potentiale mikroelektrode ændrer sig som funktion af log af ionen aktivitet. Når bevæges frem og tilbage i nærheden af en kilde eller vask af ionen (dvs. i en koncentrationsgradient grundet ionflux) mikroelektrode potentiale svinger med en amplitude proportional med ionstrøm / gradient. Forstærkeren forstærker mikroelektrode signal og produktionen registreres på computer. Ion flux kan så beregnes ved Ficks lov om diffusion ved hjælp elektrodepotentialet udsving, udflugten af ​​mikroelektrode, og andre parametre, såsom den specifikke ion mobilitet. I dette papir, vi beskriver i detaljer den metode til måling af ekstracellulære ion strømme ved hjælp af ion-selektive selvrefererende mikroelektrode end præsentere nogle repræsentative resultater.

Introduction

Alle animalske celler er omgivet af en dobbeltlaget lipidmembran, som adskiller cytoplasmaet fra det ydre miljø. Cellen opretholder et elektrisk membranpotentiale, negativ indvendigt af aktiv transport af ioner 1. Membranpotentialet er en lagret energikilde, som cellen kan bruge til at betjene forskellige molekylære enheder i membranen 2. Neuroner og andre exciterbare celler har store membranpotentialer. Hurtig åbning af natriumkanaler kollapser membranpotentialet (depolarisering) og producerer aktionspotentialet, der transporteres langs længden af neuron 2. Bortset fra disse hurtige elektriske forandringer, mange væv og organer generere og opretholde betydelige langsigtede elektriske potentialer. For eksempel, hud og hornhindens epitel generere og vedligeholde trans-epiteliale potentialer og ekstracellulære elektriske strømme ved retningsbestemt pumpning af ioner (hovedsagelig natrium og chlorid) 3.

telt "> Mens målinger af endogen ekstracellulære elektrisk strøm ved hjælp af vibrerende sonde 4-6 og målinger af membran- eller trans-epitel potentialer ved hjælp af mikroelektrode-systemet 7-10 tillade måling af de elektriske parametre for cellemembraner og epiteliale cellelag, giver de ikke angivelse af de ion involverede arter.

Mikroelektroder med selektiv ionophor kan måle specifikke ion-koncentration i opløsning. Ion gradienter eller flux kunne måles med to eller flere elektroder på forskellige positioner. Den iboende spænding Forskydningen af ​​hver probe, ville imidlertid være forskellige, hvilket forårsager unøjagtige målinger eller endda påvisning af en gradient, der ikke var til stede. En enkelt elektrode, der anvendes i "self-referering" -tilstand, hvorved den bevæger sig ved lav frekvens mellem to punkter løser dette problem. Nu ion flux kan ses på baggrund af en forholdsvis langsom og stabilt signal drift (se figur 3B). </p>

Den ion-følsomme måle system bruger ionselektive selvrefererende mikroelektroder at detektere små ekstracellulære fluxe af ioner tæt på væv eller enkeltceller. Systemet består af en forstærker, som behandler signalet fra mikroelektroden og en mikro stepmotor og driver til at styre bevægelsen af ​​mikroelektrode. Den ionselektive mikroelektrode og referenceelektroden, der lukker kredsløbet er forbundet til forstærkeren via en hovedtrin forforstærker (figur 1A). Computersoftware bestemmer parametrene for mikroelektrode bevægelse (frekvens, afstand) og også registrerer udgangen af ​​forstærkeren. Stepmotor styrer mikroelektrode bevægelse via en tredimensional micropositioner. En lav frekvens vibrerende ionselektiv mikroelektrode blev først udviklet i 1990 for at måle specifik calciumflux 11. Samt calcium, kommercielt tilgængelige ionofore cocktails er nu tilgængelige at gøre microelectrodes følsom over for natrium, chlorid, kalium, hydrogen, magnesium, nitrat, ammonium, fluorid, lithium eller kviksølv.

Grundlæggende selvrefererende ionselektiv mikroelektrode teknik omdanner aktiviteten af ​​en specifik ion opløst i en opløsning til et elektrisk potentiale, som kan måles ved et voltmeter. Ionoforen cocktail er en ikke-blandbar væske (organisk, lipofil) fase med ionbyttende egenskaber. Ionoforen selektivt komplekser (bindingssted) specifikke ioner reversibelt og overfører dem mellem den vandige opløsning indeholdt i mikroelektrode (elektrolyt), og den vandige opløsning, hvori mikroelektrode er nedsænket (figur 1D). Denne ionoverførsel fører til en elektrokemisk ligevægt og en variation af den elektriske spænding mellem mikroelektroden og referenceelektroden måles af voltmeter. Spændingen er proportional med logaritmen til den specifikke ion aktivitet ifølge Nernst equation tillader beregning af ionkoncentrationen (figur 2A og B).

På nuværende tidspunkt tillader flere systemer måling af ion flux ved anvendelse af en lignende koncept eller princip. For eksempel Scanning Ion-selektive elektroder Technique (Siet) 12,13 eller mikroelektroden Ion Flux Estimation (MIFE) udviklet af Newman og Shabala 14-16 er kommercielt tilgængelige og almindeligt anvendt af forskningsmiljøet for at bestemme specifik ion flusmidler forekommer på cellemembranen og væv på tværs af en bred vifte af dyr, planter og enkelt levende celle modeller. Ion-selektive mikroelektroder er blevet anvendt til at måle hydrogen, kalium og calcium flux hen planterødder 17, chlorid flux i rotte cerebrale arterier 18 og i pollen rør 19, brint flux i skate retinale celler 20, calcium flux i museknoglemarvs 21 forskellige ion flusmidler i svampehyfer 22 og i rved hornhinden 23, og endelig calciumflux under enkelt celle sårheling 12,24. Se også følgende anmeldelse af detaljerede oplysninger om ionselektive selvstændige henvisninger mikroelektroder 25.

Følgende artikel beskriver i detaljer, hvordan man forbereder og udfører måling af endogene ekstracellulære ionstrømme hjælp af ion-selektive selvrefererende mikroelektrode teknik på enkelt celle niveau.

Protocol

1. Ion-selektive Self-henvisninger mikroelektrode Forberedelse Fremstilling af ionselektiv mikroelektrode Varme trække tyndvæggede borsilicat kapillærer uden glødetråd (1,5 mm ydre diameter, 1,12 mm indvendig diameter) under anvendelse af en mikroelektrode aftrækker. Bemærk: Dette giver tips 3-4 um i diameter. Mindre tip har højere modstand, som gør mikroelektroder mere modtagelige for elektronisk støj og er også forbundet med en langsommere reaktion på en ændring i ion-koncentrat…

Representative Results

Vi har tidligere vist, at calcium tilstrømning vises efter enkelt celle sårede 24. Vi spurgte derfor, om andre ionstrømme forekomme ved enkelt celle sårdannelse. Vi brugte X. laevis oocyt, en veletableret model for enkelt celle sårheling 30-34 og elektrofysiologiske optagelse 24,35-39. Interessant, kaliumioner er mere koncentrerede inde X. laevis-oocytter (ca. 110 mM) 40 end i den ekstracellulære opløsning, der anvendes (i MMR 1x: 1 mM), hvilket antyde…

Discussion

De mest kritiske trin for en vellykket måling af ekstracellulære ionstrømme in vivo er: reduktion af støjen, den korrekte fremstilling af ionselektive mikroelektroder og referenceelektrode, og placeringen af prøven og begge elektroder.

For at minimere støj, bør registreringssystemet være i en jordet (jordforbundet) Faradays bur fortrinsvis med en metal-topped (vibrationsisolering) tabel, som også er jordforbundet. Desuden bør mikroskopet chassis også jordforbindes. Kilder…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.

Materials

IonAmp   BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA none amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32   BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA none software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Headstage pre-amplifier  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA INA116 BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep Driver  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA none three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Manual micropositioner   World Precision Instruments  Model KITE-R Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Magnetic stand    World Precision Instruments Model M10 Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Vibration isolation table   Newport Inc.      Model VW-3036-OPT-023040 Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces Newport Inc.      Model 360-90 Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table
Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel Newport Inc.      460PD-X none
Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel Newport Inc. 460A-XY none
Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament  World Precision Instruments  TW150-4 none
Electrode puller  Narishige  PC-10 none
Metal rack Made in-house none Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel
Oven QL Model 10 Lab Oven none
Silanization solution I  Sigma-Aldrich 85126 Hazardous, handle as recommended by provider 
Glass Petri dish; Pyrex Fisher Scientific 316060 none
Electrode/micropipette storage jar World Precision Instruments  E215 none
Glass dessicator Fisher Scientific 08-595E Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.
Plastic Pasteur pipette  Fisher Scientific 11597722 none
Bunsen burner Fisher Scientific S97329 none
Microscope slide Sigma-Aldrich S8902 none
Straight microelectrode holder Warner Instruments QSW-A15P with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire
Straight microelectrode holder  World Precision Instruments MEH3S with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector 
6 cm Petri dish VWR 60872-306 none
Nitex mesh Dynamic Aqua-Supply Ltd. NTX750 none
Glue; Loctite epoxy VWR 500043-451 Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing
Deionized water  Sigma-Aldrich 99053 none
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653 none
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9333 none
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016 none
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266 none
Hepes Sigma-Aldrich H3375 none
Sodium Hydroxyde Sigma-Aldrich S8045 none
Potassium Acetate Sigma-Aldrich P1190 none
Agarose Sigma-Aldrich A9539 none
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
  2. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
  3. Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
  4. Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
  5. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
  6. Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  7. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  8. Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
  9. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
  10. McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
  11. Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
  12. Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. , 235-252 (1999).
  13. Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , 109-137 (2006).
  14. Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
  15. Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
  16. Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
  17. Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
  18. Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
  19. Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
  20. Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
  21. Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
  22. Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
  23. Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411 (2011).
  24. Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
  25. Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. H. . Electrochemical Methods for Neuroscience. , (2007).
  26. Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
  27. Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
  28. Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D., Momirović, K., Mildner, V. Ch. 48. Compstat. , 317-321 (1990).
  29. Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. . Graphical methods for data analysis. , (1983).
  30. Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
  31. Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
  32. Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
  33. Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
  34. Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
  35. Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
  36. Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
  37. Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. , 491-497 (1982).
  38. Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
  39. Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
  40. Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
  41. Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
  42. Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
  43. McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
  44. Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
  45. Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
  46. McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
  47. McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).

Tags

Ion-selective Self-referencing MicroelectrodeExtracellular Ion FluxIon TransportCell MembraneCell LayerIon GradientFick’s Law Of DiffusionIon Flux MeasurementCalciumPotassiumSodium
check_url/fr/52782?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Luxardi, G., Reid, B., Ferreira, F., Maillard, P., Zhao, M. Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique. J. Vis. Exp. (99), e52782, doi:10.3791/52782 (2015).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image