Meting van de extracellulaire Ion Flux gebruik van de Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Techniek
Summary
Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.
Abstract
Cellen van dieren, planten en enkele cellen worden omsloten door een barrière genoemd celmembraan dat het cytoplasma van buitenaf scheidt. Cellagen zoals epithelia vormen een barrière die de binnenzijde scheidt van buitenaf of verschillende compartimenten van multicellulaire organismen. Een belangrijk kenmerk van deze barrières is het differentieel verdeling van de ionen door celmembranen en cellagen. Twee eigenschappen maken het mogelijk deze verdeling: 1) membranen en epithelia weer selectieve permeabiliteit voor specifieke ionen; 2) ionen worden vervoerd door middel van pompen door de celmembranen en cellagen. Deze eigenschappen spelen een cruciale rol in het behoud van het weefsel fysiologie en fungeren als het signaleren signalen na beschadiging, tijdens reparatie, of onder pathologische aandoening. De ion-selectieve zichzelf verwijzende micro-elektrode maakt metingen van specifieke fluxen van ionen zoals calcium, kalium of natrium in enkele cel en weefsel niveau. De micro-elektrode bevat een ionofoor cocktail dieselectief permeabel is voor een specifiek ion. De interne vulling oplossing bevat een set concentratie van het ion van belang. De elektrische potentiaal van de micro-elektrode wordt bepaald door de externe concentratie van de ionen. Aangezien de ionenconcentratie varieert het potentieel van de micro-elektrode verandert als een functie van de log van de ion activiteit. Wanneer heen en weer bewogen buurt van een bron of sink van de ionen (bijvoorbeeld in een concentratiegradiënt vanwege ion flux) de micro-elektrode potentiaal schommelt de amplitude evenredig is met de ion flux / gradiënt. De versterker versterkt het micro-elektrode signaal en de uitgang wordt op de computer. De ionenflux kan dan berekend met de wet van Fick diffusie via de elektrodepotentiaal fluctuatie, de amplitude van micro-elektrode, en andere parameters zoals de specifieke ionenmobiliteit. In dit artikel beschrijven we in detail de methodologie om extracellulaire ion fluxen te meten met behulp van de ion-selectieve self-verwijzingen micro-elektrode eend presenteren een aantal representatieve resultaten.
Introduction
Alle dierlijke cellen zijn omgeven door een lipide dubbellaag membraan dat het cytoplasma van de buitenomgeving gescheiden. De cel onderhoudt een elektrische membraanpotentiaal, negatieve binnen, door actief transport van ionen 1. De membraanpotentiaal is opgeslagen energiebron die de cel kan gebruiken om verschillende moleculaire apparaten werken in het membraan 2. Neuronen en andere exciteerbare cellen grote membraanpotentialen. Spoedig tot natriumkanalen stort de membraanpotentiaal (depolarisatie) en produceert de actiepotentiaal die loopt langs de lengte van het neuron 2 wordt getransporteerd. Naast deze snelle elektrische veranderingen, vele weefsels en organen te genereren en aanzienlijke langdurige elektrische potentialen te handhaven. Bijvoorbeeld, huid en hoornvlies epitheel genereren en trans-epitheliale potentialen en extracellulaire elektrische stroom te handhaven door gerichte pompen van ionen (voornamelijk natrium en chloride) 3.
tent "> Hoewel metingen van endogeen extracellulair elektrische stroom met de trillende probe 4-6 en metingen van membraan of trans-epitheliale potentialen via de micro-elektrode systeem 7-10 laten meten van de elektrische parameters van celmembranen en epitheliale cellagen, ze geven geen vermelding van de ionensoort betrokken.Micro-elektroden met selectieve ionofoor kunt specifieke ion-concentratie in oplossing te meten. Ion gradiënten of flux gemeten kon worden met twee of meer elektroden op verschillende posities. Echter, zou de intrinsieke spanning drift van elke probe verschillend zijn, waardoor onnauwkeurige meting of detectie van een gradiënt die niet aanwezig was. Een enkele elektrode in "self-referencing" -modus waarbij het beweegt bij lage frequentie tussen twee punten lost dit probleem op. Nu is de ion flux kan worden gezien tegen de achtergrond van een relatief langzame en stabiele signaal drift (zie figuur 3B). </p>
De ion-gevoelige meetsysteem maakt gebruik van ion-selectieve self-verwijzingen microelectrodes om kleine extracellulaire stromen van ionen in de buurt van weefsels of enkele cellen op te sporen. Het systeem omvat een versterker die het signaal van de micro-elektrode en een micro-stappenmotor en bestuurder de beweging van de micro-elektrode besturingsprocessen. De ion-selectieve micro-elektrode en de referentie-elektrode die de schakeling sluit zijn verbonden met de versterker via een headstage voorversterker (Figuur 1A). Computer software bepaalt de parameters van de micro-elektrode beweging (frequentie, afstand) en registreert ook de uitgang van de versterker. De stappenmotor regelt de micro-elektrode beweging via een driedimensionale micropositioner. Een laagfrequent trillen ion-selectieve micro-electrode werd eerst ontwikkeld in 1990 specifieke calciumflux 11 meten. Evenals calcium, commercieel toegankelijk ionofoor cocktails zijn nu beschikbaar voor MICR makenoelectrodes gevoelig voor natrium, chloride, kalium, waterstof, magnesium, nitraat, ammonium, fluoride, lithium of kwik.
Kortom, het zichzelf verwijzende ion-selectieve micro-elektrode techniek converteert de activiteit van een specifiek ion in een oplossing in een elektrisch potentiaal, die kan worden gemeten door een voltmeter. De ionofoor cocktail is een mengbare vloeistof (biologisch, lipofiele) fase met ionenwisseling eigenschappen. De ionofoor selectief complexen (bindt) specifieke ionen reversibel en overbrengt tussen de waterige oplossing in de micro-elektrode (elektrolyt) en de waterige oplossing waarin het micro-elektrode is ondergedompeld (figuur 1D). Dit ion overdracht leidt tot een elektrochemisch evenwicht en een variatie van de elektrische potentiaal tussen de micro-elektrode en de referentie-elektrode wordt gemeten door de voltmeter. De spanning is evenredig met de logaritme van de specifieke ionen activiteit volgens de Nernst equation waardoor de berekening van de ionenconcentratie (figuur 2A en B).
Momenteel verscheidene systemen kunnen meten ionenflux met een soortgelijk concept of principe. Bijvoorbeeld, de Scanning Ion-selectieve elektrode Technique (SIET) 12,13 of de micro-elektrode Ion Flux Schatting (MIFE) techniek ontwikkeld door Newman en Shabala 14-16 zijn commercieel verkrijgbaar en veel gebruikt door de onderzoeksgemeenschap om specifieke ion te bepalen fluxen die zich op het celmembraan en weefsel in een verscheidenheid van dieren, planten en enkele levende cel modellen. Ion-selectieve micro-elektroden werden gebruikt om waterstof, kalium en calcium flux tussen plantenwortels 17, chloride flux gemeten in ratten cerebrale arteriën 18 en pollen tubes 19, waterstofflux in skate retinale cellen 20, calciumflux in muizenbeenmerg 21 verschillende ion fluxen in schimmeldraden 22 en in rbij cornea 23 en tenslotte calciumflux in eencellige wondgenezing 12,24. Zie ook de volgende beoordeling voor gedetailleerde informatie over de ion-selectieve self-verwijzingen micro-elektroden 25.
Het volgende artikel beschrijft in detail hoe te bereiden en het meten van endogene extracellulaire ion fluxen met behulp van de ion-selectieve self-verwijzingen micro-elektrode techniek op enkele cel niveau uit te voeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stappen voor een succesvolle bepaling van extracellulair ion fluxen in vivo: het verminderen van het lawaai, de correcte fabricage van de ion-selectieve microelectrodes en referentie-elektrode, en de positionering van het monster en beide elektroden.
Om de ruis te minimaliseren, dient het registratiesysteem in een geaarde (geaard) Faraday kooi voorkeur met metaal bedekte (trillingsisolatie) tafel die ook geaard. Bovendien moet de microscoop chassis worden geaard. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.
Materials
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
- Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
- Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
- Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
- Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
- McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
- Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
- Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. , 235-252 (1999).
- Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , 109-137 (2006).
- Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
- Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
- Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
- Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
- Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
- Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
- Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
- Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
- Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
- Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411 (2011).
- Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. H. . Electrochemical Methods for Neuroscience. , (2007).
- Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
- Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
- Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D., Momirović, K., Mildner, V. Ch. 48. Compstat. , 317-321 (1990).
- Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. . Graphical methods for data analysis. , (1983).
- Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
- Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
- Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
- Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
- Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
- Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
- Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. , 491-497 (1982).
- Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
- Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
- Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
- Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
- McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
- Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
- Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
- McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
- McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).
