Mesure de extracellulaire Ion flux Utilisation de l'Ion sélectif microélectrodes Technique d'auto-référencement
Summary
Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.
Abstract
Les cellules provenant d'animaux, des plantes et des cellules individuelles sont entourées par une barrière dite de la membrane cellulaire qui sépare le cytoplasme de l'extérieur. des couches de cellules telles que les épithéliums forment également une barrière qui sépare l'intérieur ou de l'extérieur des compartiments différents d'organismes multicellulaires. Une caractéristique clé de ces obstacles est la répartition différentielle des ions à travers les membranes cellulaires ou des couches de cellules. Deux propriétés permettent cette distribution: 1) les membranes et les épithéliums afficher perméabilité sélective aux ions spécifiques; 2) les ions sont transportés à travers des pompes à travers les membranes cellulaires et les couches de cellules. Ces propriétés jouent un rôle crucial dans le maintien de la physiologie des tissus et agissent comme des signaux de signalisation après les dommages, lors de la réparation, ou sous condition pathologique. L'auto-microélectrode référence à sélectivité ionique permet la mesure de flux spécifiques des ions tels que calcium, de potassium ou de sodium à des niveaux de cellules et de tissus simples. Le microélectrodes contient un cocktail de ionophore qui estsélectivement perméable à un ion particulier. La solution de remplissage interne contient une concentration d'ensemble de l'ion d'intérêt. Le potentiel électrique de la micro-électrode est déterminée par la concentration à l'extérieur de l'ion. Comme la concentration en ions varie, le potentiel de la micro-électrode varie en fonction du logarithme de l'activité des ions. En cas de déplacement d'avant en arrière près d'une source ou un puits de l'ion (par exemple dans un gradient de concentration en raison de flux d'ions) le potentiel de microélectrodes fluctue à une amplitude proportionnel au flux d'ions / gradient. L'amplificateur amplifie le signal de micro-électrodes et dont la sortie est enregistré sur l'ordinateur. Le flux ionique peut alors être calculée par la loi de diffusion de Fick en utilisant l'électrode de potentiel de fluctuation, l'excursion de micro-électrodes, et d'autres paramètres tels que la mobilité d'ions spécifique. Dans cet article, nous décrivons en détail la méthodologie pour mesurer les flux d'ions extracellulaires en utilisant l'auto-référencement microélectrodes un sélective d'ionsD présenter quelques résultats représentatifs.
Introduction
Toutes les cellules animales sont entourées d'une membrane de bicouche lipidique, qui sépare le cytoplasme de l'environnement extérieur. La cellule maintient un potentiel de membrane électrique, négative à l'intérieur, par transport actif des ions 1. Le potentiel de membrane est une source d'énergie stockée qui peut utiliser la cellule pour faire fonctionner divers dispositifs moléculaires dans la membrane 2. Les neurones et les autres cellules excitables ont de grands potentiels de membrane. Ouverture rapide des canaux sodiques potentiel effondre la membrane (dépolarisation) et produit le potentiel d'action qui est transporté le long de la longueur du neurone 2. En plus de ces changements rapides électriques, de nombreux tissus et organes et à maintenir génèrent des potentiels électriques significatifs à long terme. Par exemple, la peau et la cornée épithélium génèrent et entretiennent potentiels trans-épithéliales et des courants électriques extracellulaires par le pompage des ions directionnelle (principalement de sodium et de chlorure) 3.
tente "> Bien que les mesures de courant électrique extracellulaire endogène en utilisant la sonde vibrante 6/4 et des mesures de la membrane ou trans-épithéliales potentiels à l'aide du système de micro-électrodes 7-10 permettre la mesure des paramètres électriques des membranes cellulaires et des couches de cellules épithéliales, ils ne donnent pas de indication de l'espèce d'ions concernés.Microélectrodes avec ionophore sélectif peuvent mesurer la concentration d'ions en solution spécifique. Gradients d'ions ou de flux peuvent être mesurés avec deux ou plusieurs électrodes à différentes positions. Cependant, la variation de la tension intrinsèque de chaque sonde serait différent, causant des mesures inexactes ou même la détection d'un gradient qui était absent. Une électrode unique est utilisé en mode "auto-référencement" grâce à quoi il se déplace à basse fréquence entre deux points permet de résoudre ce problème. Maintenant, le flux d'ions peut être vu dans le contexte d'une dérive du signal relativement lent et stable (voir la figure 3B). </p>
Le système de mesure sensible aux ions utilise microélectrodes auto-référence à sélectivité ionique pour détecter de petits flux extracellulaires des ions près des tissus ou des cellules individuelles. Le système est constitué d'un amplificateur qui traite le signal de la microélectrode et un micro-moteur pas à pas et le pilote pour commander le mouvement de la microélectrode. Le micro-électrodes à sélectivité ionique et l'électrode de référence qui ferment le circuit sont connectées à l'amplificateur par l'intermédiaire d'un pré-amplificateur headstage (figure 1A). Logiciels détermine les paramètres du mouvement de micro-électrodes (fréquence, distance) et enregistre également la sortie de l'amplificateur. Le moteur pas à pas commande le mouvement de micro-électrodes par l'intermédiaire d'un micropositionneur tridimensionnel. Une faible fréquence de vibration microélectrodes sélectives d'ions a été développé en 1990 pour mesurer le flux de calcium spécifique 11. Ainsi que du calcium, des cocktails ionophores commercialement accessibles sont maintenant disponibles pour faire MICRoelectrodes sensible au sodium, chlorure, potassium, l'hydrogène, le magnésium, le nitrate d'ammonium, le fluorure de lithium, ou du mercure.
Fondamentalement, la technique de micro-électrodes à sélectivité ionique auto-référencement convertit l'activité d'un ion spécifique dissous dans une solution à un potentiel électrique, qui peut être mesurée par un voltmètre. Le cocktail d'ionophore est un liquide non miscible (, organique lipophile) de phase ayant des propriétés d'échange d'ions. L'ionophore forme un complexe se lie sélectivement (ions spécifiques) et les transfère de façon réversible entre la solution aqueuse contenue dans la micro-électrode (électrolyte) et la solution aqueuse dans laquelle est immergée la microélectrode (Figure 1D). Ce transfert d'ions conduit à un équilibre électrochimique et une variation du potentiel électrique entre la micro-électrode et l'électrode de référence est mesurée par le voltmètre. La tension est proportionnelle au logarithme de l'activité spécifique d'ions selon la Nernst equation permettant le calcul de la concentration d'ions (Figure 2A et B).
À l'heure actuelle, plusieurs systèmes permettent la mesure du flux d'ions en utilisant un concept ou un principe similaire. Par exemple, l'électrode Technique Scanning Ion sélectif (SIET) 12,13 ou le (MIFE) technique microélectrodes Ion Flux Estimation développé par Newman et Shabala 14-16 sont disponibles dans le commerce et largement utilisé par la communauté de recherche afin de déterminer ion spécifique fondants se produisant à la membrane cellulaire et tissulaire à travers une variété d'animaux, de plantes et de modèles cellulaires de vie simples. Microélectrodes ioniques sélectives ont été utilisées pour mesurer l'hydrogène, le potassium et le flux de calcium dans les racines des plantes 17, le chlorure de flux dans rat artères cérébrales 18 et dans les tubes polliniques 19, flux d'hydrogène dans des cellules rétiniennes patin 20, le flux de calcium dans les os de la souris 21, divers ions flux dans hyphes 22 et dans rà 23 cornée, et enfin le flux de calcium pendant la plaie d'une cellule unique de guérison 12,24. Voir aussi le commentaire pour plus d'informations sur l'auto-référencement microélectrodes sélectives d'ions 25.
L'article suivant décrit en détail la façon de préparer et d'effectuer la mesure des flux d'ions extracellulaires endogènes en utilisant la technique de micro-électrodes ion-sélective auto-référencement au niveau de la cellule unique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes les plus critiques pour la mesure réussie de flux ioniques extracellulaires in vivo sont les suivants: la réduction du bruit, la fabrication correcte du microélectrodes référence et électrode à sélectivité ionique, et le positionnement de l'échantillon et les deux électrodes.
Afin de minimiser le bruit, le système d'enregistrement doit être mis à la terre dans un (terre) de préférence cage de Faraday avec un (isolation des vibrations) surmonté ta…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.
Materials
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
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