Die Messung der extrazellulären Ionenflüsse Verwendung der ionenselektiven selbst verweisMikroElektroden-Technik
Summary
Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.
Abstract
Zellen von Tieren, Pflanzen und Einzelzellen durch eine Barriere genannt Zellmembran in das Cytoplasma von außen trennt umschlossen. Zellschichten wie Epithelien bilden ebenfalls eine Barriere, die von außen nach innen oder verschiedenen Kompartimenten mehrzelligen Organismen trennt. Ein Schlüsselmerkmal dieser Hindernisse ist die differentielle Verteilung der Ionen über die Zellmembranen oder Zellschichten. Zwei Eigenschaften erlauben diese Verteilung: 1) Membranen und Epithelien zeigen selektive Permeabilität auf bestimmte Ionen; 2) Ionen werden durch Pumpen durch die Zellmembranen und Zellschichten transportiert. Diese Eigenschaften spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gewebephysiologie und fungieren als Signal Hinweise nach der Beschädigung während der Reparatur oder unter pathologischen Zustand. Die ionenselektive selbst verweisMikroElektrode ermöglicht Messungen bestimmter Flüsse von Ionen, wie Calcium, Kalium oder Natrium auf Einzelzell und Gewebespiegel. Die Mikroelektrode enthält ein Ionophor Cocktail, der istselektiv durchlässig, um eine bestimmte Ion. Die interne Fülllösung enthält eine Reihe Konzentration des Ions von Interesse. Das elektrische Potential der Mikroelektrode wird durch die Außen Konzentration des Ions bestimmt. Da die Ionenkonzentration variiert, ändert sich das Potential der Mikroelektrode in Abhängigkeit von dem Logarithmus der Ionenaktivität. Wenn vor und zurück in der Nähe einer Quelle oder Senke des Ions (dh in einem Konzentrationsgradienten aufgrund Ionenfluß) bewegt die Mikroelektrodenpotential schwankt mit einer Amplitude proportional zu der Ionenfluss / Steigung. Der Verstärker verstärkt das Mikroelektrodensignal und das Ausgangssignal wird auf dem Rechner aufgezeichnet. Ionenflusses kann dann durch Fickschen Diffusionsgesetz unter Verwendung der Elektrode Potentialschwankung, die Auslenkung der Mikroelektrode und andere Parameter, wie die spezifische Ionenmobilitäts berechnet werden. In diesem Artikel beschreiben wir im Detail das Verfahren zur Berechnung der extrazellulären Ionenflüsse zu messen unter Verwendung der ionenselektiven selbst verweisMikroElektrode eind präsentieren einige repräsentative Ergebnisse.
Introduction
Alle Tierzellen sind durch eine Lipiddoppelschicht-Membran, die das Zytoplasma von der äußeren Umgebung trennt umgeben. Die Zelle hält einen elektrischen Membranpotentials negativ innen, durch aktiven Transport von Ionen 1. Das Membranpotential ist eine gespeicherte Energiequelle, die die Zelle zu verwenden, um verschiedene molekulare Vorrichtungen in der Membran 2 zu betreiben. Neuronen und anderen erregbaren Zellen verfügen über große Membranpotentialen. Schnelles Öffnen von Natriumkanälen kollabiert das Membranpotential (Depolarisation) und erzeugt das Aktionspotential, das entlang der Länge des Neurons 2 transportiert wird. Abgesehen von diesen schnellen elektrischen Veränderungen, viele Gewebe und Organe erzeugen und aufrechtzuerhalten signifikante langfristige elektrische Potentiale. Zum Beispiel, Haut und Hornhaut-Epithel erzeugen und aufrechtzuerhalten transepitheliale Potenziale und extrazelluläre elektrische Ströme durch gerichtetes Pumpen von Ionen (vor allem Natrium und Chlorid) 3.
Zelt "> Während Messungen von endogenem extrazellulären elektrischen Strom unter Verwendung des vibrierenden Sonde 4-6 und Messungen der Membran oder transepithelialen Potentiale mit der Mikroelektrodensystem 7-10 ermöglichen die Messung der elektrischen Parameter der Zellmembranen und epithelialen Zellschichten, geben sie keinen Angabe der beteiligten Ionenspezies.Mikroelektroden mit selektive Ionophor können bestimmte Ionenkonzentration in der Lösung zu messen. Ionengradienten oder Flußmittel könnte mit zwei oder mehr Elektroden, die an verschiedenen Positionen gemessen werden. Jedoch würde die intrinsische Spannungsdrift jeder Sonde unterschiedlich sein, was zu ungenauen Messungen oder Detektion eines Gradienten, der nicht vorhanden war. Eine einzelne Elektrode in "selbstverweis" -Modus verwendet werden, wobei es bei niedrigen Frequenzen bewegt zwischen zwei Punkten löst dieses Problem. Nun ist die Ionenfluss kann vor dem Hintergrund einer relativ langsamen und stabilen Signaldrift zu sehen ist (siehe 3B). </p>
Die ionensensitiven Messsystem verwendet ionenselektiven selbst verweisende Mikroelektroden auf kleine extrazellulären Flüsse von Ionen in der Nähe von Gewebe oder einzelne Zellen zu erkennen. Das System besteht aus einem Verstärker, der das Signal von der Mikroelektrode und einem Mikro-Schrittmotor und Treiber, um die Bewegung des Mikrokontrollverfahren. Die ionenselektive Mikroelektroden und die Referenzelektrode, die den Stromkreis zu schließen sind, um den Verstärker über einen heads Vorverstärker (1A) verbunden ist. Computer-Software bestimmt, welche Parameter der Mikrobewegung (Frequenz, Entfernung) und zeichnet den Ausgang des Verstärkers. Der Schrittmotor steuert die Mikrobewegung über eine dreidimensionale Mikropositionierers. Ein Niederfrequenzvibrationsionenselektive Mikroelektroden wurde erstmals 1990 entwickelt, die spezielle Calciumfluss 11 zu messen. Sowie Calcium, sind kommerziell zugänglich Ionophor Cocktails jetzt für MICR machenoelectrodes empfindlich Natrium, Chlorid, Kalium, Wasserstoff, Magnesium, Nitrat, Ammonium, Fluorid, Lithium oder Quecksilber.
Grundsätzlich wandelt das selbst verweisende ionenselektive Mikroelektroden-Technik die Aktivität eines spezifischen Ions in einer Lösung gelöst, in ein elektrisches Potential, das von einem Voltmeter gemessen werden kann. Das Ionophor Cocktail ist eine nicht mischbare Flüssigkeit (organisch lipophile Phase) mit Ionenaustauscheigenschaften. Das Ionophor selektiv Komplexe (bindet) spezifische Ionen reversibel und überträgt sie zwischen der in der Mikroelektrode (Elektrolyt) enthaltenen wässrigen Lösung und der wässrigen Lösung, in der die Mikroelektrode eingetaucht ist (Figur 1D). Diese Ionentransfer führt zu einer elektrochemischen Gleichgewichts und eine Änderung des elektrischen Potentials zwischen der Mikroelektrode und der Referenzelektrode wird durch das Voltmeter gemessen. Die Spannung ist proportional zu dem Logarithmus der spezifischen Ionenaktivität nach der Nernst equation ermöglicht die Berechnung der Ionenkonzentration (2A und B).
Derzeit mehrere Systeme ermöglichen die Messung von Ionenfluss mit einem ähnlichen Konzept oder Prinzip. Zum Beispiel kann die Scanning ionenselektive Elektrode Technique (SIET) 12,13 oder der Mikroelektrode Ion Flux Estimation (MIFE) Technik, die von Newman und Shabala 14-16 entwickelt sind im Handel erhältlich und weit von der Forschungsgemeinschaft, um bestimmte Ionen zu bestimmen Flüsse an Zellmembran und Gewebe vorkommenden in einer Vielzahl von Tieren, Pflanzen und einzelnen lebenden Zellmodellen. Ionenselektive Mikroelektroden wurden verwendet, um Wasserstoff, Kalium- und Calciumflusses über die Pflanzenwurzeln 17, Chlorid Flussmittel in Ratten zu messen Hirnarterien 18 und in Pollenschläuchen 19, Wasserstofffluss in Skate Retinazellen 20, Calcium-Fluss in Mausknochen 21, verschiedene Ionen Flüsse in Pilzhyphen 22 und in rbei Hornhaut 23 und schließlich Calciumfluss während der einzelnen Zelle Wundheilung 12,24. Siehe auch die folgende Rezension für detaillierte Informationen über ionenselektiven selbst verweisende Mikroelektroden 25.
Der folgende Artikel beschreibt im Detail, wie die Vorbereitung und durchführen Messung der endogenen extrazellulären Ionenflüsse mit der ionenselektiven selbst verweisende Mikroelektroden-Technik auf Einzelzellebene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Messung der extrazellulären Ionenflüsse in vivo sind: die Verringerung der Geräusche, die korrekte Herstellung des ionenselektive Mikroelektroden und die Referenzelektrode und die Positionierung der Probe und den beiden Elektroden.
Um den Lärm zu minimieren, sollte das Aufzeichnungssystem in einem geerdeten (geerdet) Faraday-Käfig, vorzugsweise mit einem Metall-Spitze (Schwingungsisolation) Tabelle, die ebenfalls geerdet ist, sein…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.
Materials
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
- Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
- Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
- Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
- Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
- McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
- Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
- Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. , 235-252 (1999).
- Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , 109-137 (2006).
- Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
- Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
- Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
- Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
- Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
- Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
- Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
- Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
- Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
- Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411 (2011).
- Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. H. . Electrochemical Methods for Neuroscience. , (2007).
- Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
- Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
- Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D., Momirović, K., Mildner, V. Ch. 48. Compstat. , 317-321 (1990).
- Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. . Graphical methods for data analysis. , (1983).
- Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
- Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
- Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
- Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
- Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
- Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
- Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. , 491-497 (1982).
- Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
- Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
- Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
- Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
- McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
- Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
- Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
- McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
- McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).
