Medición de la extracelular Ion fundentes Uso del referencias Ion selectivo microelectrodos Técnica
Summary
Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.
Abstract
Las células de animales, plantas y células individuales están encerradas por una barrera llamada la membrana celular que separa el citoplasma desde el exterior. Capas de células tales como epitelios también forman una barrera que separa el interior del exterior o diferentes compartimentos de organismos multicelulares. Una característica clave de estas barreras es la distribución diferencial de iones a través de membranas celulares o capas de células. Dos propiedades permiten esta distribución: 1) membranas y epitelios presentan permeabilidad selectiva a iones específicos; 2) iones son transportados a través de bombas a través de las membranas celulares y capas de células. Estas propiedades juegan un papel crucial en el mantenimiento de la fisiología del tejido y actúan como una señal de señales después de los daños, durante la reparación, o bajo condición patológica. La referencia a sí misma microelectrodo selectiva de iones permite mediciones de flujos específicos de iones tales como calcio, potasio o sodio en los niveles de células y tejidos individuales. El microelectrodo contiene un cóctel ionóforo que espermeable selectivamente a un ion específico. La solución de relleno interna contiene una concentración conjunto de los iones de interés. El potencial eléctrico de la microelectrodo se determina por la concentración fuera del ión. Como la concentración de iones varía, el potencial de la microelectrodo cambia como una función del logaritmo de la actividad de los iones. Cuando se mueve hacia atrás y adelante cerca de una fuente o sumidero del ion (es decir, en un gradiente de concentración debido a flujo de iones) el potencial microelectrodo fluctúa a una amplitud proporcional al flujo de iones / gradiente. El amplificador amplifica la señal de microelectrodos y la salida se registra en el ordenador. El flujo de iones se puede calcular entonces por la ley de difusión de Fick usando la fluctuación electrodo de potencial, la excursión de microelectrodo, y otros parámetros tales como la movilidad de iones específico. En este trabajo se describe en detalle la metodología para medir los flujos de iones extracelulares utilizando la autorreferencia microelectrodo un ion-selectivod presentar algunos resultados representativos.
Introduction
Todas las células animales están rodeadas por una membrana de bicapa lipídica que separa el citoplasma del ambiente exterior. La célula mantiene un potencial de membrana eléctrica, negativa en el interior, por el transporte activo de iones 1. El potencial de membrana es una fuente de energía almacenada que la célula puede utilizar para operar diversos dispositivos moleculares en la membrana 2. Las neuronas y otras células excitables tienen grandes potenciales de membrana. Apertura rápida de los canales de sodio se colapsa el potencial de membrana (despolarización) y produce el potencial de acción que es transportado a lo largo de la longitud de la neurona 2. Aparte de estos rápidos cambios eléctricos, muchos tejidos y órganos generan y mantienen los potenciales eléctricos significativos a largo plazo. Por ejemplo, la piel y el epitelio corneal generar y mantener los potenciales de trans-epiteliales y corrientes eléctricas extracelulares por bombeo direccional de iones (principalmente sodio y cloruro) 3.
tienda de campaña "> Mientras que las mediciones de corriente eléctrica extracelular endógena usando la sonda vibrante 4-6 y mediciones de la membrana o trans-epiteliales potenciales utilizando el sistema de microelectrodo 7-10 permitir la medición de los parámetros eléctricos de las membranas celulares y capas de células epiteliales, no dan indicación de las especies de iones implicados.Microelectrodos con ionóforo selectivo pueden medir la concentración de iones específicos en solución. Gradientes de iones o de flujo podrían ser medidos con dos o más electrodos en diferentes posiciones. Sin embargo, la variación de la tensión intrínseca de cada sonda sería diferente, provocando mediciones inexactas o incluso la detección de un gradiente de que no estaba presente. Un único electrodo utilizado en el modo de "auto-referenciación" por la cual se mueve a baja frecuencia entre dos puntos resuelve este problema. Ahora el flujo de iones puede ser visto en el contexto de una deriva de señal relativamente lento y estable (véase la Figura 3B). </p>
El sistema de medición sensible a los iones utiliza microelectrodos de autorreferencia selectivos de iones para detectar pequeños flujos extracelulares de iones cerca de los tejidos o células individuales. El sistema consta de un amplificador que procesa la señal desde el microelectrodo y un motor paso a paso y micro controlador para controlar el movimiento de la microelectrodo. El microelectrodo selectiva de iones y el electrodo de referencia que cerrar el circuito están conectados al amplificador a través de un cabezal de la platina pre-amplificador (Figura 1A). Software de ordenador determina los parámetros del movimiento microelectrodo (frecuencia, distancia) y también registra la salida del amplificador. El motor paso a paso controla el movimiento a través de un microelectrodo microposicionador tridimensional. Una baja frecuencia de vibración de microelectrodos selectivo de iones fue desarrollado por primera vez en 1990 para medir el flujo de calcio específico 11. Así como el calcio, cócteles ionóforos comercialmente accesibles ahora están disponibles para hacer microelectrodes sensible al sodio, cloruro, potasio, hidrógeno, magnesio, nitrato, amonio, fluoruro, litio o mercurio.
Básicamente, la técnica de microelectrodo selectiva de iones de autorreferencia convierte la actividad de un ion específico disuelto en una solución en un potencial eléctrico, que puede ser medida por un voltímetro. El cóctel de ionóforo es un líquido inmiscible fase (orgánica, lipófilo) con propiedades de intercambio iónico. El ionóforo complejos selectivamente (se une) iones específicos reversible y los transfiere entre la solución acuosa contenida en el microelectrodo (electrolito) y la solución acuosa en la que se sumerge el microelectrodo (Figura 1D). Esta transferencia de iones conduce a un equilibrio electroquímico y una variación del potencial eléctrico entre el microelectrodo y el electrodo de referencia se mide por el voltímetro. El voltaje es proporcional al logaritmo de la actividad del ión específico de acuerdo con la Nernst equation permitiendo el cálculo de la concentración de iones (Figura 2A y B).
En la actualidad, varios sistemas permiten la medición del flujo de iones usando un concepto o principio similar. Por ejemplo, la técnica de electrodo de exploración de ion selectivo (SIET) 12,13 o la técnica de microelectrodos Ion Flux Estimation (MIFE) desarrollado por Newman y Shabala 14-16 están comercialmente disponibles y ampliamente utilizados por la comunidad de investigación con el fin de determinar ion específica fundentes que ocurre en la membrana celular y el tejido a través de una variedad de modelos de células vivas individuales animal, vegetal y. Microelectrodos selectivos de iones se han utilizado para medir hidrógeno, potasio y flujo de calcio a través de raíces de la planta 17, cloruro de flujo en las arterias cerebrales de rata 18 y 19 en los tubos de polen, flujo de hidrógeno en células de la retina del patín 20, el flujo de calcio en el hueso del ratón 21, vario ion flujos de hifas fúngicas 22 y en ren la córnea 23, y finalmente el flujo de calcio en las células sola herida de curación 12,24. Ver también la siguiente revisión para obtener información detallada sobre autorreferencia microelectrodos selectivos de iones 25.
El siguiente artículo describe con detalle cómo preparar y llevar a cabo la medición de los flujos de iones extracelulares endógenos mediante la técnica de microelectrodos autorreferencia selectivo de iones a nivel de células individuales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más críticos para la medición exitosa de los flujos de iones extracelulares in vivo son: la reducción del ruido, la fabricación correcta de los microelectrodos y referencia selectivos de iones del electrodo, y el posicionamiento de la muestra y ambos electrodos.
Con el fin de minimizar el ruido, el sistema de grabación debe estar en una puesta a tierra (puesta a tierra) jaula de Faraday preferiblemente con una mesa (aislamiento de vibraciones) de metal-rematada que t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.
Materials
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
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