Mätning av extracellulärt jonflöden Använda Jonselektiv självrefererande mikroelektrod Teknik
Summary
Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.
Abstract
Celler från djur, växter och enstaka celler omges av en barriär som kallas cellmembranet som skiljer cytoplasman från utsidan. Cellskikt såsom epitel bildar även en barriär som separerar insidan från utsidan eller olika avdelningar av multicellulära organismer. En viktig del av dessa hinder är skillnaden fördelningen av joner över cellmembraner eller cellskikt. Två egenskaper ger denna fördelning: 1) membran och epitel visar selektiv permeabilitet för specifika joner; 2) joner transporteras genom pumparna över cellmembran och cellskikt. Dessa egenskaper spelar avgörande roller för att upprätthålla vävnads fysiologi och fungerar som signal ledtrådar efter skada, vid reparation eller under patologiska tillstånd. Den jonselektiva självrefererande mikroelektrod tillåter mätningar av specifika flöden av joner såsom kalcium, kalium eller natrium vid encelliga och vävnadsnivåer. Den mikro innehåller en jonofor cocktail som ärselektivt permeabelt för en specifik jon. Den interna fyllningslösning innehåller en inställd koncentration av jonen av intresse. Den elektriska potentialen hos den mikroelektrod bestäms av utsidan koncentrationen av jonen. Som jonkoncentrationen varierar ändrar potentialen i mikroelektrod som en funktion av logaritmen av jonaktivitet. När de förflyttas fram och tillbaka i närheten av en källa eller sjunka av jonen (dvs. i en koncentrationsgradient på grund av jonflöde) mikroelektroden potentialen fluktuerar vid en amplitud proportionell mot jonflödet / lutning. Förstärkaren förstärker mikroelektroden signalen och utsignalen registreras på datorn. Jonflödet kan då beräknas genom Ficks diffusionslag användning elektrodpotentialen fluktuation, utsvängningen av mikroelektrod, och andra parametrar, såsom den specifika jonrörlighet. I detta dokument beskriver vi i detalj metod för att mäta extracellulära jonflöden använder jonselektiva självrefererande mikro end presentera några representativa resultat.
Introduction
Alla djurceller är omgivna av ett lipiddubbelskikt membran som separerar cytoplasman från den yttre miljön. Cellen upprätthåller en elektrisk membranpotential, negativ inuti, genom aktiv transport av joner 1. Membranpotentialen är en lagrad energikälla som cellen kan använda för att driva olika molekylära enheter i membranet 2. Nervceller och andra exciterbara celler har stora membranpotentialer. Snabb öppning av natriumkanaler kollapsar membranpotentialen (depolarisation) och alstrar aktionspotentialen som transporteras utmed längden av neuron 2. Bortsett från dessa snabba elektriska förändringar, många vävnader och organ skapa och upprätthålla betydande långsiktiga elektriska potentialer. Till exempel, hud och hornhinnan epitel generera och upprätthålla trans epitelceller potentialer och extracellulära elektriska strömmar genom riktad pumpning av joner (främst natrium och klorid) 3.
tält "> Även om mätningar av endogena extracellulära elektrisk ström med hjälp av vibrerande sond 4-6 och mätningar av membran eller trans-epitelceller potentialer med hjälp av mikrosystemet 7-10 tillåta mätning av elektriska parametrar i cellmembran och epitelceller cellager, ger de inte uppgift om jontyper inblandade.Microelectrodes med selektiv jonofor kan mäta specifik jonkoncentration i lösning. Jongradienter eller flussmedel kunde mätas med två eller flera elektroder vid olika positioner. Emellertid skulle den inneboende spänningsdrift av varje sond vara olika, vilket orsakar felaktiga mätningar eller även detektering av en lutning som inte var närvarande. En enda elektrod som används i "självrefererande" -läge, varigenom den rör sig vid låg frekvens mellan två punkter löser detta problem. Nu jonflödet kan ses mot bakgrund av en relativt långsam och stabil signaldrift (se figur 3B). </p>
Mätsystemet jonkänsligt använder jonselektiva självrefererande mikroelektroder för att upptäcka små extracellulära flöden av joner nära vävnader eller enstaka celler. Systemet består av en förstärkare som behandlar signalen från mikroelektroden och en mikrostegmotor och föraren att kontrollera rörelsen av mikroelektrod. Den jonselektiva mikroelektroden och referenselektroden som sluta kretsen är anslutna till förstärkaren via en huvudsteg för-förstärkaren (Figur 1A). Dator program bestämmer parametrarna för mikroelektroden rörelsen (frekvens, avstånd) och även registrerar utsignalen från förstärkaren. Stegmotorn styr mikrorörelsen via en tredimensionell micropositioner. En låg frekvens vibrerande jonselektiva mikro utvecklades först år 1990 för att mäta specifik kalciumflöde 11. Samt kalcium, kommersiellt tillgängliga jonofora cocktails finns nu att göra microelectrodes känsliga för natrium, klorid, kalium, väte, magnesium, nitrat, ammonium, fluorid, litium eller kvicksilver.
I grund och botten omvandlar självrefererande jonselektiva mikroelektrodteknik aktiviteten av en specifik jon löstes i en lösning till en elektrisk potential, som kan mätas med en voltmeter. Jonoforen cocktail är en oblandbar vätska (organisk, lipofil) fas med jonbytande egenskaper. Jonoforen komplex selektivt (binder) specifika joner reversibelt och överför dem mellan vattenlösningen som finns i mikro (elektrolyt) och vattenlösningen där mikro är nedsänkt (Figur 1D). Denna jonöverföring leder till en elektrokemisk jämvikt och en variation av den elektriska potentialen mellan mikroelektroden och referenselektroden mäts med voltmetern. Spänningen är proportionell mot logaritmen för specifik jon aktivitet enligt Nernsts equation tillåter beräkningen av jonkoncentrationen (Figur 2A och B).
För närvarande flera system tillåter mätning av jonflöde använder ett liknande koncept eller princip. Till exempel Scanning jonselektiv elektrod Technique (SIET) 12,13 eller mikroelektrod Ion Flux Estimation (MIFE) teknik som utvecklats av Newman och Shabala 14-16 är kommersiellt tillgängliga och används i stor utsträckning av forskarsamhället i syfte att fastställa specifik jon flöden förekommer vid cellmembranet och vävnaden i en mängd olika djur, växter och enda levande cellmodeller. Jonselektiva mikroelektroder har använts för att mäta väte, kalium och kalciumflöde över växtrötter 17, klorid flöde i råtta cerebrala artärer 18 och i pollenslangar 19, väteflöde i skridsko retinala celler 20, kalciumflöde i mus ben 21, olika jon flöden i svamphyfer 22 och i rpå hornhinnan 23, och slutligen kalciumflöde under en enda cell sårläknings 12,24. Se även följande recension för detaljerad information om jonselektiva självrefererande mikroelektroder 25.
Följande artikel beskriver i detalj hur man förbereder och utför mätning av endogena extracellulära jonflöden hjälp av jonselektiva självrefererande mikroteknik vid den enda cellnivå.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiska stegen för framgångsrik mätning av extracellulära jonflöden in vivo är följande: en minskning av bullret, den korrekta tillverkningen av jonselektiva mikroelektroder och referenselektrod, och placeringen av provet och båda elektroderna.
För att minimera buller, bör registreringssystemet vara i ett jordat (jordad) Faradays bur företrädesvis med en metallskiva (vibrationsisolering) bord som också är jordad. Dessutom bör mikroskopet chassit även vara jo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.
Materials
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
- Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
- Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
- Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
- Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
- McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
- Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
- Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. , 235-252 (1999).
- Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , 109-137 (2006).
- Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
- Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
- Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
- Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
- Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
- Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
- Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
- Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
- Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
- Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411 (2011).
- Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. H. . Electrochemical Methods for Neuroscience. , (2007).
- Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
- Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
- Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D., Momirović, K., Mildner, V. Ch. 48. Compstat. , 317-321 (1990).
- Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. . Graphical methods for data analysis. , (1983).
- Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
- Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
- Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
- Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
- Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
- Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
- Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. , 491-497 (1982).
- Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
- Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
- Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
- Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
- McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
- Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
- Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
- McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
- McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).
