Method Article

Méthode de mesure de l'activité des enzymes de dé-ubiquitination dans des lignées cellulaires et des échantillons de tissus

DOI:

10.3791/52784

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May 10th, 2015

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1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Women’s Heath, University of Minnesota, 4Masonic Cancer Center, University of Minnesota

In This Article

Summary

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Le protocole actuel détaille un procédé pour mesurer l'activité des enzymes fonctionnellement homologue désubiquitination. Sondes spécialisées modifier de manière covalente l'enzyme et permettent de détecter. Cette méthode a le potentiel d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Abstract

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Le système ubiquitine-protéasome a été récemment impliqué dans différentes pathologies dont les maladies neurodégénératives et des cancers. À la lumière de cela, des techniques pour étudier le mécanisme de régulation de ce système sont essentielles pour élucider les processus cellulaires et moléculaires des maladies susmentionnées. L'utilisation de l'hémagglutinine dérivée d'ubiquitine sondes décrites dans le présent document constitue un outil précieux pour l'étude de ce système. Ce document décrit en détail une méthode qui permet à l'utilisateur d'effectuer des tests qui donnent une visualisation directe de l'activité enzymatique désubiquitination. Enzymes de dé-ubiquitination contrôlent dégradation par le protéasome et partager homologie fonctionnelle sur leurs sites actifs, ce qui permet à l'utilisateur d'enquêter sur l'activité de plusieurs enzymes dans un essai. Lysats sont obtenus grâce à une rupture mécanique doux cellulaire et incubées avec site actif sondes dirigées. Enzymes fonctionnelles sont étiquetés avec les sondes en enzymes inactives demeurent non. En termeNing cet essai, l'utilisateur obtient des informations à la fois sur l'activité et l'expression potentielle de plusieurs enzymes de dé-ubiquitination d'une manière rapide et facile. La méthode actuelle est nettement plus efficace que d'utiliser des anticorps individuels pour les cent prédits enzymes de dé-ubiquitination dans la cellule humaine.

Introduction

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Le système ubiquitine-protéasome (UPS) sert comme l'une des principales voies de dégradation dans la cellule de mammifère. Substrats liés à la dégradation dans le protéasome sont étiquetés de manière covalente avec des polymères de l'ubiquitine (Ub) 1. Avant le substrat ciblé entre le protéasome de dégradation, l'étiquette de poly-ubiquitine doit être retiré. Une classe d'enzymes appelées enzymes de dé-ubiquitination (DUB) est responsable de l'élimination et le recyclage des molécules d'ubiquitine 2. Il a été prédite à partir du génome humain qui, il ya près d'une centaine DUBs travaillant dans la cellule 3.

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Protocol

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1. Préparation Lysis Buffer

  1. Dissoudre saccharose dans déminéralisée (DI) de l'eau pour faire un bouillon solution 2 M. Filtrer une solution 2 M de saccharose en utilisant un vide poussé de 0,22 um polyfluorure de vinylidène (PVDF) filtre.
  2. Dissoudre dithiothréitol (DTT) dans de l'eau DI pour faire un mM solution et magasin 500 dans des conditions anaérobies. Dissoudre le chlorure de magnésium (MgCl 2) dans de l'eau DI pour faire un bouillon solution 100 mM. Dissoudre l'adénosine triphosphate (ATP) disodique hydraté dans de l'eau DI pour faire un bouillon solution à 50 mM.
  3. Préparer une solution de Tris à un ....

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Results

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Cellules M17 et HeLa cultivées ont été récoltées en utilisant la méthode détaillée dans le (Cell récolte 3.) protocole et les tissus de la moelle épinière de souris a été obtenu. L'/ tissu de la moelle épinière culot cellulaire a été placé dans un tube avec le tampon de lyse décrit dans la section de préparation des réactifs. Les culots cellulaires ont été lysés en utilisant des billes de verre (Figure 1A) et des échantillons de tissus de moelle épinière de souris ont été homogénéisées en utilisant un h.......

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Discussion

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Depuis ubiquitination est une activité cellulaire fondamental, la compréhension des mécanismes de régulation pourrait être la clé pour déterrer les processus de la maladie et de la pathologie. L'utilisation de HA marqué sites dirigé sondes actives Ub dérivés rapportés ici fournit une méthode simple, mais très applicable pour l'étude de la dégradation des protéines Ub-médiation. Cette méthode est plus rapide et moins coûteux que d'étudier chacun des DUBs individuellement.

Dans ce .......

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Disclosures

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Les auteurs ont rien à révéler.

Acknowledgements

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Nous tenons à remercier le laboratoire Lee de l'Université du Minnesota pour fournir les échantillons de tissus de la moelle épinière de souris qui ont été utilisés. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Défense Programme Cancer de l'ovaire de la recherche (OCRP) de OC093424 à MB, par le Fonds communautaire de recherche et cancer Randy Shaver MB et par le Minnesota Cancer de l'ovaire Alliance (MOCA) à MB. Les bailleurs de fonds ne jouaient aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou de la préparation du manuscrit.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PowerGen 125 (homogénéisateur)Fischer Scientific14-261-02P
Filtres à vide 0.22 µ ; mBPV2210
Perles de verre, lavées à l’acide & ; 106 et micro ; m (~140 Tamis américain)Sigma-aldrichG4649-10G
SaccharoseFischer ScientificS6-212
DL-dithiothreitolSigma-AldrichD0632
Chlorure de magnésiumSigma-AldrichM8266
Adénosine 5'-triphosphate disodium sel hydratéSigma-AldrichA26209
Chlorhydrate de trizmaSigma-AldrichT3253
Dulbecco’s Modified Eagle MediumLife Technologies11965-092
Saline tamponnée au phosphateLife Technologies10010-023
Fiole de culture tissulaire 75 cm2 avec gobelet filtrant 250 ml 120/csCellstarT-3001-2
0,05 % Trypsine-EDTA (1x)Life Technologies25300-054
HI FBSLife Technologies16140-071
Anticorps monoclonal anti-HA produit chez la sourisSigma-AldrichH9658
Ubiquitine vinyl sulfone (HA-tag)Enzo Life SciencesBML-UW0155-0025
Laemmli’s SDS-Sample Buffer (4x, réducteur)Boston BioProductsBP-110R
Pierce BCA Protein Kit de dosageThermo Scientific23225

References

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  1. Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
  2. Wilkinson, K. D.

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Deubiquitinating Enzyme ActivityHA Derived ProbesWestern Blot AnalysisCell Lysate PreparationMechanical Cell LysisProtein Concentration AssayChemiluminescent DetectionActive Site LabelingEnzyme Activity ProfilingPVDF Membrane Transfer

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