Imagerie non invasive de la réponse immunitaire innée dans un modèle de poisson zèbre larves de<em> Streptococcus iniae</em> Infection

Summary

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Abstract

L'agent pathogène aquatique, Streptococcus iniae, est responsable de plus de 100 millions de dollars de pertes annuelles pour l'industrie de l'aquaculture et est capable de provoquer une maladie systémique dans les deux poissons et les humains. Une meilleure compréhension de S. maladie iniae pathogénie nécessite un système de modèle approprié. La traçabilité génétique et la transparence optique des premiers stades de développement du poisson zèbre pour permettre la génération et l'imagerie non-invasive de lignées transgéniques avec étiqueté par fluorescence des cellules immunitaires. Le système immunitaire adaptatif est pas complètement fonctionnel jusqu'à plusieurs semaines après la fécondation, mais larves de poisson zèbre ont un système immunitaire inné de vertébré conservé à la fois les neutrophiles et les macrophages. Ainsi, la génération d'un modèle d'infection larvaire permet l'étude de la contribution spécifique de l'immunité innée dans le contrôle de S. infection iniae.

Le site de micro-injection permettra de déterminer si une infection estsystémique ou localisée initialement. Ici, nous présentons nos protocoles pour l'injection de vésicule otique du poisson zèbre âgés de 2-3 jours après la fécondation ainsi que nos techniques d'imagerie confocale de fluorescence de l'infection. Un site d'infection localisée permet l'observation de l'invasion microbienne initiale, recrutement des cellules hôtes et la diffusion de l'infection. Nos résultats en utilisant le modèle des larves de poisson zèbre de S. iniae infection indiquent que le poisson zèbre peut être utilisé pour examiner les différents apports de neutrophiles et les macrophages d'accueil dans les infections bactériennes localisées. En outre, nous décrivons comment photomarquage des cellules immunitaires peut être utilisé pour suivre le destin des cellules hôte individuel au cours de l'infection.

Introduction

Streptococcus iniae est un agent pathogène aquatique majeur qui est capable de provoquer une maladie systémique dans les poissons et les humains ^1. Bien que S. iniae est responsable de pertes importantes dans l'industrie de l'aquaculture, ce est aussi un agent pathogène zoonotique potentiel, capable de provoquer une maladie chez les hôtes humains immunodéprimés atteints de pathologies cliniques similaires à ceux causés par d'autres agents pathogènes humains streptocoques. Compte tenu de ses similitudes avec des agents pathogènes humains, il est important d'étudier S. iniae pathogenèse des maladies dans le contexte d'un hôte naturel. Un modèle de poisson zèbre adulte de S. infection iniae a révélé l'infiltration robuste de leucocytes d'accueil sur le site de l'infection localisée ainsi comme un temps rapide d'accueillir la mort, un temps trop court pour impliquer le système immunitaire adaptatif ^7. Afin d'obtenir un regard en profondeur dans la réponse immunitaire innée à S. iniae infection in vivo, il est nécessaire d'utiliser un modèle qui est plus favorable à nsur-invasive imagerie en temps réel.

Le poisson zèbre larves a un certain nombre d'avantages qui en font un modèle vertébré plus en plus attrayant pour étudier les interactions hôte-pathogène. Poisson zèbre sont relativement peu coûteux et facile à utiliser et à entretenir par rapport aux modèles de mammifères. L'immunité adaptative est pas fonctionnellement matures jusqu'à 4-6 semaines après la fécondation, mais les larves ont un système immunitaire inné des vertébrés hautement conservée avec le complément, Toll-like récepteurs, les cytokines et les neutrophiles et les macrophages avec des capacités antimicrobiennes y compris la phagocytose et la bouffée respiratoire ^{2-6, 8-11.} En outre, la traçabilité génétique et la transparence optique des stades embryonnaires et larvaires de développement pour permettre la génération de lignées transgéniques stables avec les cellules immunitaires marquées par fluorescence permettant d'étudier les interactions hôte-pathogène en temps réel in vivo. La génération de ces lignées transgéniques en utilisant une protéine photoconvertible tels que DenDRA2 permet le suivi de l'origine de la cellule hôte et le destin individuel au cours de l'infection ^12.

Lors de l'élaboration d'un modèle d'infection des larves de poisson zèbre, le site choisi de microinjection permettra de déterminer si une infection est initialement localisée ou systémique. Infections du sang systémique dans la veine caudale ou un conduit de Cuvier sont les plus couramment utilisées pour étudier les pathogènes microbiens chez le poisson zèbre et sont utiles pour étudier les interactions entre l'hôte et des cellules microbiennes, les réponses de cytokines, et les différences de virulence entre les souches pathogènes. Pour les micro-organismes à croissance plus lente, une injection précoce dans le sac vitellin d'un embryon au stade 16-1,000 cellulaire peut être utilisée pour générer une infection systémique ^13,14, avec le stade de développement optimal pour la micro-injection d'un micro-organisme à croissance lente jugée entre l'étape 16 à 128 de la cellule ^15. Toutefois, le jaune injections sac de nombreux microbes à des stades ultérieurs de développement hôte ont tendance à être mortelle à til accueillera en raison de l'environnement riche en nutriments pour le microbe et le manque de leucocytes infiltrants ^16-18.

Une infection localisée se traduit généralement par la migration dirigée des leucocytes vers le site de l'infection qui peut être facilement quantifiée par imagerie non invasive. Ce type d'infection peut permettre pour la dissection des mécanismes qui interviennent dans la migration des leucocytes ainsi que des enquêtes de différentes capacités migratoires et phagocytaires de diverses populations leucocytaires. Infections localisées sont également utiles lors de l'examen des différences de virulence entre les souches bactériennes ainsi que l'étude des mécanismes d'invasion de microbes depuis barrières de l'hôte physiques doivent être croisés pour une infection localisée à devenir systémique. Poisson zèbre sont généralement soulevé à des températures de 25-31 ° C ^19, mais ils peuvent aussi être maintenu à des températures aussi élevées que 34 à 35 ° C pour les études de l'envahissement de certains agents pathogènes humains avec les exigences de température strictespour la virulence ^{20, 21.}

De nombreux sites différents ont été utilisés pour générer une infection bactérienne localisée initialement compris le ventricule du cerveau postérieur ^22, queue muscle dorsal ^18, la cavité péricardique ^23, et la vésicule otique (oreille) ^{5, 16, 24.} Cependant, il a été trouvé que l'injection des bactéries en queue muscle peut causer des dommages aux tissus et l'inflammation indépendante des bactéries, ce qui peut fausser les résultats lorsque l'enquête réponse des leucocytes ^13. Bien que moins de dommages est associé à l'injection dans le cerveau postérieur et bien que ce est d'abord dépourvu de leucocytes chez les jeunes embryons, le ventricule rhombencéphale gagne progressivement les cellules immunitaires dans le temps que les microglies se installent. Le ventricule rhombencéphale est également un endroit plus difficile à l'image. La vésicule otique est une cavité creuse fermée sans accès direct à la vascularisation ^{25, 26.} Il est normalement dépourvue de leukocytes leucocytes, mais peuvent être recrutés pour la vésicule otique en réponse à des stimuli inflammatoires telles que l'infection. Il est également un site privilégié de la micro-injection de bactéries chez le poisson zèbre ans après la fécondation (DPF) 2-3 jours en raison de la facilité d'imagerie et la visualisation de l'injection. Par conséquent, nous avons choisi la vésicule otique que notre site d'infection bactérienne localisée.

Protocol

Adultes et embryonnaires poisson zèbre ont été maintenus en conformité avec l'Université du Wisconsin-Madison recherche Ressources Animales Center. 1. Préparation de microinjection Aiguilles Préparer aiguilles d'injection capillaire en verre de paroi mince (1,0 OD / 0,75 ID) en utilisant un dispositif micropipette extracteur avec les paramètres suivants: pression d'air 200, la chaleur 502, tirez 90, vitesse 80, heure 70, heure de l'air au début de la tract…

Representative Results

Microinjection de S. iniae dans la vésicule otique (Figure 1 et Figure 2) conduit à une réponse de l'hôte initialement localisée. Lorsqu'elle est injectée correctement, les bactéries doivent seulement être vu dans la vésicule otique et non dans le tissu ou le sang environnant. Ceci peut être visualisé au cours de la micro-injection en utilisant un colorant rouge de phénol (figure 1A). Alternativement, si bactéries marquées sont injectées,…

Discussion

La méthode d'infection utilisé ici est utile pour l'étude de la réponse immunitaire de l'hôte à une infection localisée initialement dans 2 à 3 dpf embryons et les larves. La mise au point d'un stimulus inflammatoire, comme une infection, dans une cavité fermée de telle sorte que la vésicule otique permet l'étude de la chimiotaxie de neutrophiles et de macrophages et de phagocytose. Une mise en garde de l'injection de bactéries dans la vésicule otique est que la capacité des neutro…

Materials

1.7 ml eppendorfs	MidSci	AVSS1700
14 ml falcon tube	BD Falcon	352059
27 G x 1/2 in. needle	BD Biosciences	305109
96 well plate	Corning Incorporated	3596
Agar	BD Biosciences	214030
CellTracker Red	Molecular Probes, Invitrogen	C34552
CNA agar	Dot Scientific, Inc	7126A
Disposable transfer pipets	Fisher Scientific	13-711-7m
Dissecting Scope	Nikon	SMZ745
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
Ethanol 200 proof	MDS	2292
Fine tweezers	Fine Science Tools	11251-20
Gel comb	VWR	27372-482	4.2 mm width, 1.5 mm thick
Glass bottom dishes			Custom made by drilling a 16–18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4
High melt agarose	Denville Scientific, Inc.	CA3510-6
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	H325
Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	with FV-1000 system
Low melt agarose	Fisher	BP165-25
Magnetic stand	Tritech (Narishige)	GJ-1
Microinjection system	Parker	Picospritzer III
Microloader pipet tips	Eppendorf	930001007
Micromanipulator	Tritech (Narishige)	M-152
Micropipette puller	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97
Nanodrop spectrophotmeter	Thermo Scientific	ND-1000
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma aldrich	P7629
Paraformaldheyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875712	100 mm x 15 mm
Phenol	Sigma Aldrich	P-4557
Phenol Red	Ricca Chemoical Company	572516
Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	BP665-1
Potassium hydroxide	Sigma Aldrich	P-6310
Pronase	Roche	165921
Protease peptone	Fluka Biochemika	29185
Small cell culture dish	Corning Incorporated	430165	35 mm x 10 mm
Sudan Black	Sigma Aldrich	S2380
Thin wall glass capillary injection needles	World Precision Instruments, Inc.	TW100-3
Todd Hewitt	Sigma Aldrich/Fluka Analytical	T1438
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)	Argent Chemical Laboratory/Finquel	C-FINQ-UE-100G
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Yeast extract	Fluka Biochemika	92144