À faire et à ne pas faire dans la préparation de Muscle cryosections pour l'analyse histologique

Summary

Nous démontrons ici les méthodes les plus efficaces pour la congélation, l’intégration, la cryosection et la coloration des biopsies musculaires afin d’éviter la congélation des artefacts.

Abstract

Examen histologique des biopsies musculaires a servi comme un outil indispensable dans la compréhension du développement et la progression de la pathologie des troubles neuromusculaires. Toutefois, afin de le faire, des soins appropriés doivent être prises lorsque l'excision et la préservation de tissus pour obtenir une coloration optimale. Une méthode de préservation des tissus consiste à fixer les tissus en formaldéhyde, puis les incorporer à la cire de paraffine. Cette méthode préserve la morphologie bien et permet le stockage à long terme à température ambiante, mais est lourde et nécessite une manipulation de produits chimiques toxiques. En outre, des résultats formaldéhyde de fixation à l'antigène reticulation, ce qui nécessite des protocoles d'extraction d'antigène efficace pour immunocoloration. Au contraire, le sectionnement congelé ne nécessite pas de fixation et conserve ainsi biologique antigène conformation. Cette méthode fournit également un avantage distinct à son tour rapide autour du temps, ce qui rend particulièrement utile dans les situations nécessitant une évaluation histologique rapide comme intraoperative biopsies chirurgicales. Ici, nous décrivons la méthode la plus efficace de préparer des biopsies musculaires pour la visualisation avec différents colorants histologiques et immunologiques.

Introduction

L'examen de l'histologie des muscles joue un rôle critique dans la compréhension des différents types de troubles neuromusculaires ^4.1. Lorsqu'il est combiné avec d'autres techniques, il permet aux chercheurs d'obtenir une meilleure idée de la manifestation et de la progression de la pathologie et peuvent aussi être essentiel pour évaluer l'efficacité d'une intervention thérapeutique ^5-10. Toutefois, pour être précis, les tissus doivent être préservées de la manière appropriée afin de préserver immédiatement l'état physiologique avant l'excision. Cela exige un grand soin lors de l'enlèvement, de la préserv....

Protocol

1. Tissue récolte et de congélation des tissus musculaires

1. Euthanasier la souris avec une dose excessive de l'isoflurane (2-chloro-2- (difluorométhoxy) -1,1,1-trifluoro-éthane). Effectuez cette étape dans une hotte et utiliser une méthode de confinement secondaire comme un dessiccateur ou une cloche de verre contenant un coton-tige imbibé d'isoflurane.
2. Confirmer la mort en serrant fermement coussinet plantaire. Utilisez une méthode secondaire de l'euthanasie telle que la dislocation cervicale.
3. Mouiller la fourrure avec 70% d'alcool pour réduire le collage des mèches de cheveux en vrac sur les muscles. Peler la peau du me....

Results

La mise en place pour la récolte et la congélation des tissus peut être vu sur la figure 1. Tissus excisés doivent être stockés sur une gaze trempée dans du PBS afin d'éviter le séchage (figure 1A). Lorsque les tissus sont sélectionnés pour être utilisé pour l'analyse histologique, ils devraient être trempés dans de l'OCT et disposés sur cryo moule dans le bon sens et que près de la longueur physiologique que possible pour assurer la morphologie précise (figure 1B). Sus.......

Discussion

Histologie et immunohistochimie ont été utilisés comme outils essentiels à la compréhension de la manifestation et l'évolution de la pathologie dans divers troubles neuromusculaires. Classiquement, les biopsies musculaires ont d'abord été fixés dans du formol puis intégrés avec de la cire de paraffine. Le formaldéhyde fixation préserve l'architecture des tissus et permet le stockage de tissus et de transport à température ambiante, il inactive également des enzymes et protéines reticulations nécessitant des .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryostat	Leica CM 1850	Leica Microsystems Inc.	Buffalo Grove, IL 60089 États-Unis, téléphone bureau 1-800-248-0123 Alternative : Richard Allen Scientific
Microscope	Nikon Eclipse 50i	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 États-Unis, Téléphone : 1-631-547-8500 Alternative : Olympus
Logiciel d’analyse d’images	Logiciel d’imagerie Nikon Logiciel d’imagerie Recherche fondamentale	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, États-Unis, Téléphone : 1-631-547-8500 Alternatives : Image J, Metamorph
Isoflurane	14043-220-05	JD Medical Dist. Co., Inc.	1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 États-Unis
OCT	4583	Sakura Inc.	Torrence, CA 90501 U.S.A. Source alternative : Leica Microsystem
Freeze It	23-022524	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Source alternative : VWR
Scientific Moule en tissu jetable	22-363-554	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific
Colorfrost plus slides	9991001	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific
Acetone	650501-4L	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific
Alcool éthylique	HC-1300-1GL	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific
2-methyl butane	M 32631-SL	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific
Xylene	HC-7001GA	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific
Cytoseal 280	8311-4	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific
Hematoxylin Gill #3	CS402-1D	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific
Eosin	6766007	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific