공 초점 광학 이미징에 의해 로즈 벵갈 Photothrombosis<em> 생체</em> : 단일 선박 스트로크의 모델
Summary
Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.
Abstract
In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.
Introduction
바로 로즈 벵갈 유도 다음과 같은 생체 내 세포 반응의 기술 설명을 허용 시각화는 그대로 마우스에 photothrombosis. 로즈 벵골 (4,5,6,7- 테트라 클로로 -2 ', 4', 5 ', 7'- tetraiodofluorescein)는 동물 모델에서 허혈성 뇌졸중 (마우스 및 래트)을 유도하기 위해 사용되는 감광성 염료이다. 564 nm의 레이저 광에 얇게 두개골을 통해 꼬리 정맥을 통해 조사 및 후속 RB의 볼 루스 주입 후, 혈전 생리적 뇌졸중을 일으키는 한 유도된다. 이 방법은 원래 1977 년에 로젠과 엘 Sabban 설명하고, 이후 1980 년대 중반 1, 2에서 왓슨에 의해 채택되었다. 요컨대, 로즈 벵갈이어서 조직 인자, 혈액 응고 캐스케이드의 개시제를 활성화 반응성 산소 종의 생성을 생성 녹색 여기 광 (우리의 경우에 561 nm의 레이저)을 조사한다. 응고 캐스케이드의 유도는 레 허혈성를 생산임상 스트로크 3 병리학 관련 이온.
스트로크는 뉴런, 아교 세포, 내피 세포 및 면역계 세포 등 다양한 종류의 상호 작용으로 인해 복잡한 기전을 갖는다. 최고의 기술을 선택하는 것은 특정 세포 프로세스가 여러 고려 사항을 필요로 공부한다. 실험 방법은 세 개의 범주에 폭넓게 나뉘어 시험 관내에서, 각각 갖는 장단점 생체 내 및 실리코 체외 연구는 자연 환경으로부터 세포를 제거하는 주요 단점이 있으므로 그대로 볼 효과를 재현 할 수있다. 살아있는 동물. 생체 기법 증가 병진 의미와 질환 상태의 개선 실험 복제를 제공한다. 실리코 일반적 질환 또는 세포 처리의 컴퓨터 모델링을 의미하며, 점점 시험을위한 잠재적 약물 상호 작용을 연구하는데 이용하면서PLE, 수집 된 정보는 여전히 세포 나 조직 생활에서 테스트해야합니다.
실험실 설정에서 뇌졸중의 이상적인 모델은 인구에서 본 것과 유사한 병리학 적 특징을 설명한다. 인구 뇌졸중 일반적인 생리적 특성이 있지만, 손상 발생의 종류에 따라 많은 차이도있다. 인구의 스트로크는 다양한 경색 볼륨뿐만 아니라 각 병리에 관한 메커니즘의 차이에 그 결과 크고 작은 혈관 폐색, 출혈 병변과 동맥이나 심장 – 색전증 동맥에 발생합니다. 뇌졸중 동물 모델을 이용하는 이점은 인간 스트로크 특성을 모방 재현성 경색의 발생이다. 중간 대뇌 동맥 폐색 (색전이나 혈관 필라멘트 방법)하는 모델 말단 MCAO 및 photothrombosis 모델 : 가장 일반적인 동물 스트로크 모델은 사용 동맥 폐쇄를 포함한다. 장점각 모델의 D 단점은 (4 및 5 참조) 다른 곳에서 검토되고있다. 글로벌 허혈성 모델 (MCAO), 수행 상대적으로 쉬운 초점 뇌졸중 모델보다 인간의 스트로크에 덜 관련이있다. 또한, 이러한 방법은 재현성 뇌 경색 병변을 유도 매우 다양하다. 실험이 MCAO 모델을 통해 분명한 이점을 제공 아니라 자신의 실험을 제어로 photothrombosis 모델만큼 높은 재현성이다. 그러나, 미세 혈관 비방에 모델은 최소한의 허혈성 주변부, 세포 -6,7- 살릴 것으로 생각되는 영역을 표시하기 위해 설명되었다. 또한 vasogenic 부종 및 세포 독성 부종 형성은 또한 이미징 영역의 다음 조사를 유도 할 수있다. 이러한 제한에도 불구하고 기술은 스트로크 8, 9, 10, 11 다음의 많은 생리적 과정에 새로운 통찰력을 제공했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간의 응용 프로그램에 동물 실험에서 스트로크 병태 생리를 번역 할 수있는 능력은 실패로 고생하고있다. 그러나, 이러한 모델 photothrombosis 같은 동물 모델의 사용은 개선 된 뇌졸중 병태 생리에 대한 이해와 스트로크 다음 신경 보호를 제공하기위한 새로운 치료 적 접근법의 탐색을 허용한다. 작은 대뇌 피질의 스트로크와 photothrombotic 모델에 의해 생성 microinfarctions은 높은 유병률을 가지고 있?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for this work was provided by: AG007218 and NIH F32 AG031606.
Images were generated in the Core Optical Imaging Facility, which is supported by UTHSCSA, NIH-NCI P30 CA54174 (CTRC at UTHSCSA) and NIH-NIA P01AG19316.
Materials
| Reagents | |||
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | |
| Isoflurane Anesthetic | MWI Veterinary Supply | 088-076 | |
| Vetbond | 1469SB | 1469SB | |
| aCSF | 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4). | ||
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Dissecting Scissors | Bioindustrial Products | 500-410 | |
| Operating scissors 14 cm | Bioindustrial Products | 12-055 | |
| Forceps Dumont High Tech #5 style, straight | Bioindustrial Products | TWZ-301.22 | |
| LabJack 132X80 | Optosigma Co | 123-6670 | |
| Platform for Labjack 8X 8 | Optosigma Co | 145-1110 | |
| Ear bar holder from stereotaxic setup | Stoelting/Cyborg | 51654 | |
| Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine | DRE, Inc. | 15001 | |
| Tech IV Isoflurane vaporizer | DRE, Inc. | 34001 | |
| F Air Canister | DRE, Inc | 80120 | |
| Bain circuit breathing tube | DRE, Inc | 86111B | |
| Rodent adapter for bain tube | DRE, Inc | 891000 | |
| O2 regulator for oxygen tanks | DRE, Inc | CE001E | |
| Rodent induction chamber | DRE, Inc | 15004C | |
| Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle | Suture Express | 1639G | |
| Objective inverter Optical Adapter | LSM technologies | ||
| Foredom drill Dual voltage 110/120 | Foredom | 134.53 |
References
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