흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em> 생체</em>와<em> 체외</em> 분석 실험
Summary
This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.
Abstract
흉선 정착 전구 세포를 특성화하는 lymphopenic 환자에서 T 세포의 교체를위한 전략을 고안하는 것이 필수적, T 세포의 발달 단계 전 흉선을 이해하는 것이 중요하다. 우리는 체외에서 보완이에 의해 쥐의 배아 일 13, 18 thymi에서 전구 세포를 정착 흉선을 공부하고 생체 기술에 모두 "매달려 드롭"방법에 따라. 이 방법은 E13 및 / 또는 E18 그들의 자손 다음 따라서 CD45 allotypic 마커에 의해 구별 흉선 조상을 조사 태아 흉선 로브를 식민지화 허용했다. 인구 중 하나와 식민지가 가능한 경쟁력있는 선택적 압력을 제거하는 동안 혼합 인구 식민는 전구 세포의 생물학적 특성 세포 자치 차이를 분석하는 허용한다. 식민 흉선 로브는 또한 t의 인구 역학 생체 내 성숙 된 T 세포의 자손의 수 분석 면역 결핍받는 수컷 마우스에 이식 할 수있다그는 면역 체계와 다른 조직과 장기의 식민지를 주변. 태아 흉선 기관 배양 E13 전구 세포 모두에 빠른 속도로 개발 CD3 + 세포를 성숙 것으로 나타났다 및 수지상 상피 T 세포로 알려진 표준 γδ T 세포 하위 집합에 상승했다. 이에 비해, E18 전구 세포는 분화가 지연 및 수지상 상피 성 T 세포를 생성 할 수 없었다. – / – 흉선 이식 CD3의 말초 혈액의 모니터링 마우스는 더 E18의 흉선 정착 전구 세포는, 시간에 따라, 단기적 태아 흉선에서 감상 할 수없는 기능을 자신의 E13에 비해 성숙한 T 세포의 큰 번호를 생성하는 것으로 나타났다 기관 배양.
Introduction
T 림프구는 αβ 또는 γδ T 세포 수용체 (TCR)를 담지, 전문 기관에서 흉선 차별화. 완전히 개발 흉선은 두 가지 영역으로 구성되어 생산적 TCR의 β와 α 체인 유전자를 재 배열 흉선 세포가 프로그램의 죽음 (긍정적 인 선택으로 알려져있는 과정)에서 구출되는 흉선 조상 개발 피질, 그리고; 자기 리간드에 너무 강한 반응성과 흉선 세포를 선택한 수질은 (음 선택) 1, 2 삭제됩니다. 흉선 나중에 간엽 세포 (3)에 의해 둘러싸여 제 인두 파우치 내배엽 층에서 유래. 그것은 그 후, 연속 채용 정상 T 세포의 발달을 위해 요구되는 4 배아 일 E12과, 기점 조혈 전구 세포 식민지된다. 흉선 이민자들은 긴밀하게 규제 프로그램, 시작과 마이에 의해 조율 된, 연속적인 발달 단계를 통해 진화4처럼 그 리간드와의 상호 작용에 따라 흉선 세포의 노치 신호 전달 경로의 활성화, 델타에 의해 ntained, 흉선 상피 세포 (TEC는)에 표현 된 5.
흉선 세포 개발은 소위 CD4 시작 – CD8 – 더블 네거티브 (DN) 단계. , DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) 및 DN4 (CD25 – CD44 -) – DN의 흉선 세포는 더 DN1 (CD44 + CD25)에 CD25 및 CD44의 발현에 따라 세분화 될 수있다. CD24 (HSA)와 CD117 (C-kit)은 더 DN1a와 b는 초기 흉선 전구 세포 (ETP)에 해당하는 5 부분 집합에 DN1 함을 세분화. 흉선 세포는 DN 단계에서 TCR δ, β와 α 사슬을 재 배열 및 사전 TCR 선택 (DN3-DN4 단계)를 거쳐. TCR (α) 체인은 긍정과 부정 실리 이전에 재 배열 CD4 + CD8 + 더블 긍정적 인 (DP) 구획에 그들은 더 통과ction의. 이 단계에서 가장 흉선이 제거되고, 단지 작은 백분율 (3~5%)는 CD4 + 또는 CD8 + 도달가 T 세포를 격실 성숙.
림프 분화 경로는 다 능성 전구 세포 (MPP) 및 적혈구와 거핵 세포 6 잠재력을 잃어 림프-준비하는 다 능성 전구 세포 (LMPP)를 생성 조혈 모세포의 단계를 통해 진행한다. , 형 c-Kit (CD117)의 발현, 무서-1 및 FLT3 / Flk2 (CD135) 및 인터루킨의 검출 가능한 수준의 부재 (- LMPP는 표현형 (리니지 부정적인 린) 분화 혈액 세포 마커의 부재에 의해 정의 된 IL) -7 체인 α 수용체 (IL-7rα 또는 CD127). LMPPs 더욱 그 단계에서 골수 세포를 생성하는 능력을 상실했다고 공통 림프구 전구 세포 (CLP) 7로 분화. CLP는 림프구 (B와 T 세포), NK 세포, DC 및 선천성 림프 세포 (ILC)의 잠재력을 유지하고, CD1의 발현에 의해 LMPP 다를27 무서-1의 높은 수준의 부재.
흉선 정착 선조 (TSP)의 특성은 광범위 8 논의되었지만, 최근에 개발 된 것은 분명 9 TSP 걸쳐 변화 표현형 분화 잠재력과 기능은. 우리는 E13 (제 1 파) 또는 E18 (초 파) 중 하나에서 정렬 외과 세포에 의해 격리 TSP를 특성화하기 위해 생체 외 및 생체 내 분석을 수행. 동일 E13 및 E18 전구 세포의 수, 다른 allotypic 마커가 부착 된 식민지 유사한 개발 환경에서 그들의 자손 다음 허용 조상의 두 가지 유형의 사이에 다른 세포 고유 특성을 밝혀 조사 흉선 로브와 태아 흉선 기관 배양 (FTOC). E13 또는 E18 TSP 중 하나의 식민지 흉선 로브 인해 두 전구 세포 사이의 경쟁으로 선택하지 않고 개발을 허용했다. 식민지 흉선 로브의 생체 내 이식 더 보여 주었다 또한 T그는 E13의 성숙 자손과 E18 TSP는 생체 내에서 서로 다른 생물학적 특성을 갖는다. 제 웨이브에서 TSP를 빠르게 T 세포를 생성하고 있지만, αβ γδ T 세포의 낮은 숫자 일으킨다. 후자 중 우리는 불변 TCR, 그들은 상처 치유의 기능을 발휘하고 만 배아 발달 10시에 발생하는 표피로 마이그레이션이 Vγ5Vδ1 수지상 상피 T 세포 (DETC)를 발견했습니다. 대조적으로, TSP는 제 웨이브에서 TCR + T 세포의 높은 번호를 생성하는 시간이 오래 걸릴 DETC를 생성 할 수 없습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
두 가지 주요 분석은 T 세포의 생체 외 분화를 분석하는데 사용될 수있다. 가장 최근에보고 된 1 또는 4 내지 12 등 Noth1의 리간드, 델타 표현 BM 간질 세포 OP9 조혈 전구 세포의 공 배양된다.이 2-D 분석은에서 분석을 가능하게 고효율 민감한 수행하기 쉬운 단일 세포 수준. 그러나, 어느 쪽도 흉선 상피 세포와 직접 상호 작용을 필요로 둘 (DP)의 무대도 γδ DETC (13)의 생성, 이후 T…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
파스퇴르 연구소, INSERM, 직원은 국립 드 공들인 ANR (그랜트 'Lymphopoiesis'), REVIVE 미래를위한 투자 프로그램 및 "contre 르 암 라 리그"에 의해 지원됩니다.
Materials
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak. | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility Actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility Actions |
| Ketamine 100mg/ml (stock solution) | MERIAL | - | Anesthesic |
| Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution | AXIENCE | - | Morphinic analgesic |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | - | Eyes protection |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fœtal Calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and Streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2 b mercapto ethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1×270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
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