This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.
表征胸腺解决祖重要的是要了解T细胞发育的前期阶段,胸腺,必须设计一种T细胞置换淋巴细胞减少患者的策略。我们研究了胸腺从13鼠胚胎日和18 thymi沉降祖细胞由两个体外互补和体内技术,无论是基于“悬滴”的方法。这种方法允许辐照的殖民胸腺胎儿与叶和E13 / E18还是通过CD45异型标记,从而跟随他们的后代区分胸腺祖。定植混合种群允许分析的祖细胞生物学特性细胞自主的分歧,而与殖民人口要么尽可能去除选择性的竞争压力。殖民胸腺瓣也可以在免疫缺陷雄性受体小鼠允许成熟T细胞后代的体内分析,如叔种群动态接枝他外周免疫系统和不同的组织和器官的殖民化。胎儿胸腺器官培养透露,E13祖细胞迅速发展成为成熟的全部CD3 +细胞,引起了规范γδT细胞亚群,被称为树突状上皮性T细胞。相比之下,E18祖细胞有延迟分化和无法生成树突上皮T细胞。 / – –胸腺-接枝的CD3外周血监测小鼠进一步表明,E18胸腺沉降祖生成,随着时间的推移,更大的成熟T细胞比它们的E13对应的号码,无法在短期内胎儿胸腺可以理解的特征器官培养。
T淋巴细胞,轴承αβ或γδT细胞受体(TCR),区分在一个专门的机构,胸腺。充分发展胸腺分为两个不同的区域:皮质,其中胸腺祖发展和地点的胸腺细胞重新排列高效TCR的β和α链基因是从程序性死亡(被称为阳性选择的过程)获救;和髓质,在这里选择的胸腺细胞与太强的反应,以自配体被删除(负选择)1,2。胸腺来源于第三咽囊以为稍后由间充质细胞3包围的内胚层层。它是由起始于天胚胎E12,此后,连续招募所需的正常T细胞发育4造血祖细胞定植。胸腺移民通过连续的发育阶段发展,通过严格监管的程序,发起并策划迈ntained由胸腺Notch信号传导途径的相互作用时的活化与其配体,δ-样4,表达于胸腺上皮细胞(TECs的)5。
胸腺细胞发育开始于所谓的CD4 – CD8 –双阴性(DN)的阶段。 ,DN2(CD25 + CD44 +),DN3(CD25 + CD44 – )和DN4(CD25 – CD44 – ) – DN胸腺细胞可以根据CD25和CD44的表达到DN1(CD44 + CD25)进一步细分。 CD24(HSA)和CD117(的c-Kit)进一步细分DN1隔成5个亚群,其中DN1a和b对应于早期胸腺祖细胞(ETP)。胸腺细胞重新排列T细胞受体δ,β和α链在DN阶段,并进行预-TCR选择(DN3,DN4阶段)。他们进一步迁移到的CD4 + CD8 +双阳性(DP)室,其中的TcRα链重新排列之前正和负塞莱ction。在这个阶段,大多数胸腺细胞被消除,只有一小部分(3-5%)达到的CD4 +或CD8 +成熟T细胞室。
淋巴分化途径过程通过造血干细胞的生成多潜能祖细胞(MPP)和淋巴引发的多潜能祖细胞(LMPP)失去的红细胞和巨核细胞潜力6阶段。 LMPP由缺乏分化血细胞标记物表型定义(谱系阴性,林– ),的c-Kit(CD117)的表达,的Sca-1和Flt3的/ FLK2(CD135)和没有白细胞介素的可检测水平的( IL)-7受体α链(IL-7rα或CD127)。 LMPPs进一步分化为普通淋巴祖(CLP)7,到这个阶段已经失去了产生骨髓细胞的能力。电保留淋巴细胞(B和T细胞),NK细胞,DC和先天淋巴样细胞(ILC)的潜力,并从LMPP相差CD1的表达27,以及缺乏高水平的Sca-1的。
虽然胸腺解决祖细胞(TSP)的性质已经被广泛讨论8,它成为近日明确表示,TSP变化表型,分化潜能和功能,整个开发9。我们的体外和体内测定进行到TSP,通过FACS分离细胞从任E13(第一波)或E18(第二波)排序表征。胎儿胸腺器官培养(FTOC)与E13的E18和祖人数相等,不同的轴承异型标志殖民,使跟随他们类似的发展环境和子代细胞揭示内在特性,这两种类型的祖细胞之间的不同照射胸腺叶。无论是通过E13 E18或定植TSP胸腺叶允许开发无选择,由于双方的祖细胞之间的竞争。 在体内移植的殖民胸腺裂片进一步表明还牛逼他E13的成熟后代和E18 TSP 在体内生物不同的特性。从第一波的TSP快速生成T细胞,但引起低的数字αβγδ和T细胞。在后者我们检测Vγ5Vδ1树突上皮T细胞(DETC)中,具有一个不变的TcR,迁移到它们施加在伤口愈合的函数和胚胎发育10中仅产生的表皮。与此相反,TSP从第二波需要更长的时间,以产生高数量的TcR + T细胞和不能生成DETC。
两个主要的测定法可用于分析T细胞分化的体外 。最近报道是造血祖细胞与骨髓基质细胞,OP9的共培养,表达Noth1的配位体,δ-样1或4 12,这2-D测定是容易执行的,高效的和灵敏的,允许分析在单个细胞水平。然而,它既不支持T细胞发育超出DP的阶段也没有γδDETC 13的产生,这两者需要与胸腺上皮的直接相互作用。
FTOCs长期以来一直用于分析T细胞发育<sup…
The authors have nothing to disclose.
巴斯德研究所,INSERM,法新社国立德RECHERCHE ANR(格兰特的淋巴细胞'),兴中未来投资计划和“香格里拉法甲勒驳癌症”的支持。
90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak. | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility Actions |
Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility Actions |
Ketamine 100mg/ml (stock solution) | MERIAL | - | Anesthesic |
Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution | AXIENCE | - | Morphinic analgesic |
Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | - | Eyes protection |
DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
Fœtal Calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
Penicilin and Streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
2 b mercapto ethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
Vannas spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1×270 10318801 | For hanging drop technique |
Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |