Thymic की विशेषता का उपयोग कर माउस भ्रूण में progenitors निपटाने<em> Vivo</em> और<em> इन विट्रो</em> Assays
Summary
This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.
Abstract
Thymic निपटाने के पूर्वज निस्र्पक lymphopenic रोगियों में टी सेल प्रतिस्थापन के लिए रणनीति वसीयत करने के लिए आवश्यक है, टी सेल के विकास के पूर्व Thymic चरणों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। हम इन विट्रो में पूरक दो से murine भ्रूण दिन 13 और 18 thymi से पूर्वज निपटाने Thymic का अध्ययन किया और इन विवो तकनीक में, दोनों "फांसी ड्रॉप" विधि पर आधारित है। इस विधि E13 और / या E18 उनकी संतान निम्नलिखित इस प्रकार CD45 allotypic मार्करों और द्वारा प्रतिष्ठित Thymic पूर्वज के साथ विकिरणित भ्रूण Thymic पालियों बस्तियां की अनुमति दी। आबादी के साथ या तो बसाना संभव प्रतिस्पर्धी चयनात्मक के दबाव को हटा जबकि मिश्रित आबादी के साथ औपनिवेशीकरण progenitors के जीवविज्ञान का गुण में सेल स्वायत्त मतभेद का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। उपनिवेश Thymic पालियों भी ऐसी टी की जनसंख्या गतिशीलता के रूप में vivo में परिपक्व टी सेल संतान के विश्लेषण की अनुमति immunodeficient पुरुष प्राप्तकर्ता चूहों में grafted किया जा सकता हैवह प्रतिरक्षा प्रणाली और विभिन्न ऊतकों और अंगों के उपनिवेशन परिधीय। भ्रूण Thymic अंग संस्कृतियों E13 पूर्वज सभी में तेजी से विकसित CD3 + कोशिकाओं को परिपक्व पता चला है कि और वृक्ष के समान उपकला टी कोशिकाओं के रूप में जाना विहित γδ टी सेल सबसेट, को जन्म दिया है। इसकी तुलना में, E18 पूर्वज एक देरी भेदभाव किया है और वृक्ष के समान उपकला टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने में असमर्थ थे। / – – थाइमस-grafted CD3 के परिधीय रक्त की निगरानी चूहों आगे E18 Thymic निपटाने के पूर्वज है, समय के साथ, लघु अवधि के भ्रूण Thymic में की सराहना नहीं की जा सकी एक विशेषता है कि उनके E13 समकक्षों की तुलना में परिपक्व टी कोशिकाओं की बड़ी संख्या उत्पन्न पता चला है कि अंग संस्कृतियों।
Introduction
टी lymphocytes, αβ या γδ टी सेल रिसेप्टर (TCR) असर, एक विशेष अंग में थाइमस अलग। पूरी तरह से विकसित थाइमस दो अलग-अलग क्षेत्रों में आयोजित किया जाता है: उत्पादकता TCR β और α श्रृंखला जीन को पुनर्व्यवस्थित कि thymocytes क्रमादेशित मौत (सकारात्मक चयन के रूप में जाना जाता प्रक्रिया) से बचाया जाता है, जहां Thymic पूर्वज का विकास जहां कॉर्टेक्स, और; और आत्म ligands के लिए भी मजबूत जेट के साथ thymocytes चयनित जहां मज्जा, (नकारात्मक चयन) 1,2 नष्ट हो जाती हैं। थाइमस बाद में mesenchymal कोशिकाओं 3 से घिरा हुआ है कि तीसरे ग्रसनी थैली के endodermal परत से निकलती है। यह उसके बाद, सतत भर्ती सामान्य टी सेल विकास 4 के लिए आवश्यक है भ्रूण दिन E12 और, पर शुरू हिमेटोपोयटिक पूर्वज द्वारा उपनिवेश रहा है। Thymic आप्रवासियों एक कसकर विनियमित कार्यक्रम, शुरू की और माई द्वारा करवाया, लगातार विकास के चरणों के माध्यम से विकसित4 की तरह अपने ligand के साथ बातचीत पर thymocytes पर पायदान संकेतन मार्ग की सक्रियता, डेल्टा द्वारा ntained, Thymic उपकला कोशिकाओं (Tecs) पर व्यक्त 5।
Thymocyte विकास तथाकथित सीडी 4 में शुरू होता है – सीडी 8 – डबल नकारात्मक (डी.एन.) चरणों। , DN2 (CD25 + CD44 +) DN3 (CD25 + CD44 -) और DN4 (CD25 – CD44 -) – डी.एन. thymocytes आगे DN1 (CD44 + CD25) में CD25 और CD44 की अभिव्यक्ति के अनुसार विभाजित किया जा सकता है। CD24 (HSA) और CD117 (सी-किट) आगे DN1a और बी जल्दी Thymic पूर्वज (ईटीएफ) के अनुरूप हैं जहां 5 कैंपेन्स में DN1 डिब्बे subdivides। Thymocytes डी.एन. चरण में TCR δ, β और α जंजीरों को पुनर्व्यवस्थित और पूर्व TCR चयन (DN3-DN4 चरणों) से गुजरना। TCR α श्रृंखला सकारात्मक और नकारात्मक sele करने से पहले rearranges जहां सीडी 4 + सीडी 8 + डबल सकारात्मक (डीपी) डिब्बे में वे आगे पारगमनction है। इस स्तर पर सबसे thymocytes समाप्त हो जाते हैं और केवल एक छोटा सा प्रतिशत (3-5%) सीडी 4+ तक पहुंचने या CD8 + टी सेल डिब्बे परिपक्व।
ल्य्म्फोइड भेदभाव मार्ग multipotent पूर्वज (एमपीपी) और एरिथ्रोसाइट और महामूललोहितकोशिका 6 संभावित खो दिया है कि ल्य्म्फोइड-primed multipotent पूर्वज (LMPP) उत्पन्न कि HSCs के चरणों के माध्यम से प्रगति। सी-किट (CD117) की अभिव्यक्ति, SCA-1 और Flt3 / Flk2 (CD135) और इंटरल्यूकिन की detectable स्तर की अनुपस्थिति (- LMPP phenotypically (वंश नकारात्मक लिन) विभेदित रक्त कोशिका मार्कर की अनुपस्थिति से परिभाषित कर रहे हैं आईएल) -7 श्रृंखला α रिसेप्टर (आईएल 7rα या CD127)। LMPPs आगे कहा कि मंच द्वारा माइलॉयड कोशिकाओं को उत्पन्न करने की क्षमता खो दिया है कि आम ल्य्म्फोइड पूर्वज (सीएलपी) 7 में अंतर है। सीएलपी लिम्फोसाइट (बी और टी सेल), एन.के. सेल, डीसी और जन्मजात ल्य्म्फोइड सेल (ILC) संभावित बनाए रखने, और CD1 की अभिव्यक्ति के द्वारा LMPP से अलग27 और SCA-1 के उच्च स्तर के अभाव।
Thymic निपटाने के पूर्वज (टीएसपी) की प्रकृति को बड़े पैमाने पर 8 बहस की गई है, यद्यपि यह हाल ही में स्पष्ट हो गया है कि विकास के 9 भर में टीएसपी परिवर्तन फेनोटाइप, भेदभाव क्षमता और समारोह,। हम E13 (पहली लहर) या E18 (दूसरी लहर) से या तो छँटाई FACS सेल द्वारा पृथक टीएसपी, चिह्नित करने के लिए इन विट्रो में और vivo assays में प्रदर्शन किया। बराबर E13 और E18 progenitors के नंबर, अलग allotypic मार्करों असर द्वारा उपनिवेश एक समान विकास के वातावरण में अपने संतान निम्नलिखित अनुमति दी है और progenitors के दोनों प्रकार के बीच अलग अलग सेल आंतरिक गुणों का पता चला विकिरणित Thymic खण्डों के साथ भ्रूण Thymic अंग संस्कृतियों (FTOC)। E13 या E18 टीएसपी या तो द्वारा उपनिवेश Thymic पालियों की वजह से दोनों पूर्वज के बीच प्रतियोगिता के लिए चयन के बिना विकास की अनुमति दी। उपनिवेश Thymic पालियों के vivo प्रत्यारोपण आगे से पता चला है कि यह भी टीवह E13 के परिपक्व संतान और E18 टीएसपी विवो में विभिन्न जीवविज्ञान का गुण है। पहली लहर से TSPs तेजी से टी कोशिकाओं को उत्पन्न लेकिन αβ और γδ टी कोशिकाओं की कम संख्या को जन्म दे। बाद में हम एक अपरिवर्तनीय TCR, वे घाव भरने में एक समारोह में डालती है और केवल भ्रूण के विकास के लिए 10 के दौरान उत्पादन किया जाता है, जहां एपिडर्मिस की ओर पलायन किया है कि Vγ5Vδ1 वृक्ष के समान उपकला टी कोशिकाओं (DETC), का पता चला। इसके विपरीत, टीएसपी दूसरी लहर से TCR + टी कोशिकाओं की उच्च संख्या उत्पन्न करने के लिए लंबे समय लेने के लिए और DETC उत्पन्न करने में असमर्थ हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
दो मुख्य assays के टी सेल भेदभाव पूर्व vivo विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सबसे हाल ही में सूचना दी 1 या 4 से 12 की तरह Noth1 की ligands, डेल्टा व्यक्त बी.एम. stromal कोशिकाओं, OP9 साथ hematopoietic progenitors के सह संस्कृति…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
पाश्चर संस्थान, INSERM, एजेंस नेशनल डे Recherche ANR (अनुदान 'Lymphopoiesis') को पुनर्जीवित भावी निवेश कार्यक्रम और "contre Le कैंसर ला लीग" के द्वारा समर्थित है।
Materials
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak. | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility Actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility Actions |
| Ketamine 100mg/ml (stock solution) | MERIAL | - | Anesthesic |
| Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution | AXIENCE | - | Morphinic analgesic |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | - | Eyes protection |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fœtal Calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and Streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2 b mercapto ethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1×270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
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