Caractérisation des progéniteurs thymique décantation dans l'embryon de souris Utilisation In Vivo Et In Vitro Essais

Summary

Cet article décrit une méthodologie in vivo et in vitro pour caractériser les progéniteurs de sédimentation thymique par l’analyse de la cinétique de génération, du phénotype et du nombre de leur descendance de lymphocytes T.

Abstract

Caractériser thymiques régler progéniteurs est important de comprendre les étapes de pré-thymiques du développement des cellules T, essentiels pour élaborer des stratégies pour le remplacement des cellules T chez les patients lymphopéniques. Nous avons étudié thymique régler progéniteurs de murin jour embryonnaire 13 et 18 thymus par deux complémentaires in vitro et in vivo techniques, tous deux basés sur la méthode "goutte suspendue". Cette méthode a permis de coloniser irradiés lobes thymiques foetaux avec E13 et / ou E18 progéniteurs CD45 thymiques distingués par marqueurs allotypiques et suivants de leur progéniture ainsi. La colonisation par des populations mixtes permet d'analyser les différences cellulaires autonomes dans les propriétés biologiques des progéniteurs tandis colonisation soit avec la population supprime possibles pressions sélectives compétitifs. Les lobes thymiques colonisés peuvent également être greffés chez des souris immunodéficientes bénéficiaires masculins permettant l'analyse de la descendance maturité des cellules T in vivo, tels que la dynamique des populations de til périphérique système immunitaire et la colonisation de différents tissus et organes. Des cultures d'organes thymiques foetaux révélé que progéniteurs E13 développées rapidement dans tous maturité cellules CD3 ⁺ et ont donné lieu à la sous-ensemble de cellules T γδ canonique, connu sous le nom de cellules T épithéliales dendritiques. En comparaison, les progéniteurs E18 ont un retard de différenciation et ont été incapables de générer des cellules dendritiques T épithéliale. La surveillance de sang périphérique de CD3 thymus greffé ^{- / -} souris en outre montré que les progéniteurs E18 thymique décantation génèrent, avec le temps, un plus grand nombre de cellules T matures que leurs homologues E13, une caractéristique qui n'a pas pu être apprécié dans le thymus du fœtus à court terme des cultures d'organes.

Introduction

Lymphocytes T, portant le αβ ou le récepteur de lymphocytes T γδ de (TcR), se différencient dans un organe spécialisé, le thymus. Le thymus entièrement développé est divisé en deux régions distinctes: le cortex, où progéniteurs thymiques se développent et où thymocytes qui réarrangent productive les β TCR et gènes de la chaîne α sont sauvés de la mort programmée (un processus connu sous le nom sélection positive); et la moelle, où sélectionné thymocytes trop forte réactivité aux auto-ligands sont supprimés (sélection négative) ^1,2. Le thymus est originaire de la couche endodermique de la troisième poche pharyngienne qui est ensuite entouré par ^trois

Protocol

Déclaration éthique: toutes les expériences ont été réalisées conformément à la Charte Ethique Institut Pasteur, approuvé par le ministère français de l'Agriculture, et les lignes directrices de l'UE. Un manipulateur avec une formation sur la chirurgie petit rongeur, certifié par le ministère français de l'Agriculture, effectue toutes les interventions chirurgicales.
NOTE: Voir en annexe le tableau 1 montrant la procédure du plan en 5 étapes.

1. La sélection des embryons

1. Utilisez 36 femelles C57BL / 6 CD45.2, 12 femelles CD45.1, 12 C57BL / 6 Les mâles CD45.1 et 12 C57BL / 6 mâles CD45.2. Trav....

Results

Afin de choisir une méthode d'épuiser lobes thymiques de thymocytes endogènes permettant le meilleur développement des progéniteurs colonisateurs, nous avons comparé les niveaux de T reconstitution cellulaire dans lobes thymiques colonisés après irradiation ou un désoxy-guanosine 5 jours (d-Gua) traitement. Les résultats montrent que bien qu'il n'y ait pas de différence au jour 9 de la culture, lobes irradiés contiennent plus de cellules T que ceux traités avec d-Gua, au jour 12. Ainsi, l'irradiation est plus approprié .......

Discussion

Deux principaux essais peuvent être utilisés pour analyser la différenciation des cellules T ex vivo. Le plus récemment rapporté est la co-culture de progéniteurs hématopoïétiques avec des cellules stromales BM, OP9, exprimant les ligands de Noth1, delta comme 1 ou 4 ^12. Cette analyse 2-D est facile à réaliser, très efficace et sensible, permettant une analyse à le niveau de la cellule unique. Toutefois, il ne soutient le développement des cellules T au-delà de la phase de DP ni la génération de γδ D.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Boîtes de Pétri pour la culture de tissus plastiques de 90 x 15 mm et 35 x 15 mm.	TPP	T93100/T9340	Échantillonnage
26 G & frac38 ; " Seringues de 0,45 x 10 mm avec aiguilles,	BD Plastipak	300015	Suspension cellulaire
, maille de nylon, toile de boulonnage stérilisée, pièces de 50/50 mm.	SEFAR NITEX	03-100/32	Filtration des cellules
Éthanol 70 %.	VWR	83801.36	Actions de stérilité
Iodure Povidone 10 % (Bétadine)	MEDA Pharma	314997.8	Actions de stérilité
Kétamine 100 mg/ml (solution mère)	MERIAL		Anesthésique
Xylazine 100 mg/ml dans du PBS (solution mère)	Sigma	X1251-1G	Anesthésique et relaxant musculaire
Buprénorphine 0,3 mg/ml solution mère	AXIENCE		Analgésique morphinique
Gel ophtalmique (0,2 % de cyclosporine)	Schering-Plough Animal Health		Protection oculaire
DPBS (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	14040-174	pour isoler les embryons
HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	24020-091	pour éliminer le sang et disséquer les embryons
OPTI-MEM I GlutaMAX I	GIBCO Life Technology	51985-026	Milieu pour cultures
Sérum de veau fœtal	EUROBIO	CVFSVF00-0U	additif pour cultures
Pénicilline et streptomycine	GIBCO Life Technology	15640-055	Antibiotiques pour cultures
2-Mercaptoethanol	GIBCO Life Technology	31350010	additif pour cultures
LEICA MZ6 Microscope de dissection	LEICA	MZ6 10445111	Occulaire W-Pl10x/23
Source de lampe froide	SCHOTT VWR	KL1500 compact	Deux fibres de col de cygne adaptées
Élastomère de silicone	World Precision Instruments	SYLG184	Tampon de dissection
Cuillère, ronde et perforée	Outils de sciences fines	10370-18	Outils de dissection
Fine Ciseaux à iris	Outils pour les sciences fines	14090-09	Outils de dissection
Ciseaux à ressort Vannas	Outils pour les sciences fines	15018-10	Outils pour les
fines Pince : Dumont #5/45 Inox 11 cm	F.S.T.	11253-25	Outils de dissection
2 paires de pinces d’horloger droites fines Dumont #5 11 cm pointes fines.	Fine Science Tools	11295-20	Outils de dissection
Fil de polyamide avec aiguille 6-0 C-3 3/8c	ETHICON	F2403	pour sutures
Porte-aiguille	MORIA/F.S.T.	12060-02	pour sutures
Coussin chauffant	VWR	100229-100	Pour maintenir la température de la souris pendant l’anesthésie
Membrane Isopore RTTPO2500	DUTSCHER	44210	Pour FTOC
Terasaki 60 puits	plaques FISHER	1x270 10318801	Pour la technique de la goutte suspendue
Écouvillons de gaze stériles 7,5 x 7,5 cm	Hydrex	11522	Pour appliquer une solution désinfectante
Anticorps marqués à la fluorescence ou à la biotine	BD Biosciences, Biolegend ou e-Biocsiences  ;	Nombre de clones voir tableau ci-dessous	Cellules de coloration
MACS Colonnes/Streptavidine Microbilles	Miltenyi Biotec	130-042-401/130-048-101	Épuisement cellulaire
Souris	Charles Rivers Laboratories (CD45.1) et Janvier Labs  ; (CD45.2)	C57BL/6 CD45.1 OU CD45.2	Source des cellules et des lobes thymiques
Souris	CDTA Orlé ; ans, France	CD 3 epsilon Ko CD45.2	Expérience de greffe