Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell'embrione mouse Uso<em> In Vivo</em> E<em> In Vitro</em> Saggi
Summary
This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.
Abstract
Caratterizzare timo sedimentazione progenitori è importante per comprendere le fasi di pre-timici di sviluppo delle cellule T, essenziale per elaborare strategie di sostituzione delle cellule T nei pazienti linfocitopenico. Abbiamo studiato timica stabilirsi progenitori da murino giorno embrionale 13 e 18 thymi da due complementari in vitro ed in vivo le tecniche, sia in base al metodo "goccia appeso". Questo metodo ha permesso la colonizzazione irradiati lobi del timo fetale con E13 e / o E18 progenitori timo distinguono per CD45 marcatori allotypic e successive loro progenie così. La colonizzazione con popolazioni miste consente l'analisi di cellule differenze autonome in proprietà biologiche dei progenitori, mentre la colonizzazione sia con popolazione rimuove eventuali pressioni selettive competitive. I lobi timici colonizzati possono anche essere innestati immunodeficienti topi riceventi maschi consentono l'analisi della progenie di cellule T mature in vivo, quali la dinamica di popolazione di tegli PERIFERICA sistema immunitario e colonizzazione dei vari tessuti ed organi. Colture d'organo timo fetali hanno rivelato che i progenitori E13 sviluppato rapidamente in tutto mature cellule CD3 + e hanno dato luogo al sottoinsieme di cellule T γδ canonica, noto come le cellule T epiteliali dendritiche. In confronto, i progenitori E18 hanno una differenziazione ritardata e non erano in grado di generare cellule epiteliali T dendritiche. Il monitoraggio di sangue periferico di timo-innestato CD3 – / – mice inoltre dimostrato che progenitori E18 timica decantazione generano, con il tempo, un maggior numero di cellule T mature rispetto ai loro omologhi E13, una caratteristica che non poteva essere apprezzata nel timo fetale breve termine colture d'organo.
Introduction
Linfociti T, che porta il αβ o γδ recettore delle cellule T (TCR), si differenziano in un organo specializzato, il timo. Il timo completamente sviluppato è organizzato in due regioni distinte: la corteccia, dove progenitori timiche sviluppare e dove timociti che produttivamente riorganizzare i β TCR e catena geni α sono salvati dalla morte programmata (un processo noto come selezione positiva); e il midollo, dove scelto timociti con troppo forte reattività per auto-leganti vengono eliminati (selezione negativa) 1,2. Il timo proviene dallo strato endodermico del terzo sacchetto faringeo che è poi circondata da cellule mesenchimali 3. Si è colonizzata da progenitori ematopoietici a partire da giorno embrionali E12 e, da allora in poi, il reclutamento continua è necessaria per il normale sviluppo delle cellule T 4. Immigrati del timo evolvono attraverso fasi di sviluppo successive, orchestrato da un programma strettamente regolato, iniziato e maintained per l'attivazione della via di segnalazione di Notch sui timociti in seguito all'interazione con il suo ligando, delta come 4, espresso sulle cellule epiteliali del timo (TEC) 5.
Sviluppo timocita inizia il cosiddetto CD4 – CD8 – doppia negativi (DN) fasi. Timociti DN possono essere ulteriormente suddivisi secondo l'espressione di CD25 e CD44 in DN1 (CD25 – CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) e DN4 (CD25 – CD44 -). CD24 (HSA) e CD117 (c-Kit) suddivide ulteriormente il vano DN1 in 5 sottogruppi dove DN1A e b corrispondono ai primi progenitori timo (PTE). Timociti riordinare le δ, β e α catene TCR in fase di DN e sottoposti pre-TcR selezione (stadi DN3-DN4). Essi hanno inoltre il transito al CD4 + CD8 + doppio positiva (DP) del vano in cui la catena α TcR riorganizza prima sele positivi e negativiction. In questa fase la maggior parte dei timociti sono eliminati e solo una piccola percentuale (3-5%) raggiungono il CD4 + o CD8 + T maturi vano cella.
La differenziazione percorso linfoide progredisce attraverso le tappe di HSC che generano progenitori multipotenti (MPP) e progenitori multipotenti linfoidi predisposte (LMPP) che hanno perso il eritrociti e megacariociti potenziale 6. LMPP sono fenotipicamente definito dall'assenza di marcatori di cellule del sangue differenziate (lineage negative, Lin -), l'espressione di c-kit (CD117), Sca-1 e Flt3 / Flk2 (CD135) e l'assenza di livelli rilevabili di interleuchina ( IL) -7 recettore α catena (IL-7rα o CD127). LMPPs ulteriormente differenziarsi in progenitori comuni linfoidi (CLP) 7 che a quel punto hanno perso la capacità di generare cellule mieloidi. CLP conservare linfociti (B e T cellulare), delle cellule NK, DC e cellule linfoidi innate (ILC) potenziale, e differiscono da LMPP dall'espressione di CD127 e l'assenza di elevati livelli di Sca-1.
Anche se la natura dei timici assestamento progenitori (TSP) è stato ampiamente dibattuto 8, è diventato recentemente chiaro che il cambiamento TSP fenotipo, il potenziale e la funzione di differenziazione, durante tutto lo sviluppo 9. Abbiamo eseguito in vitro e in vivo per caratterizzare il TSP, isolato da FACS cell sorting sia da E13 (prima onda) o E18 (seconda ondata). Fetali colture d'organo del timo (FTOC) con lobi timici irradiati colonizzate da un numero uguale di E13 e E18 progenitori, tenendo diversi marker allotypic, ammessi dopo la loro prole in un ambiente di sviluppo simile e rivelate cellule proprietà intrinseche, diversi tra i due tipi di progenitori. Lobi del timo colonizzati da una E13 o E18 TSP permesso lo sviluppo senza selezione a causa della concorrenza tra i due progenitori. In vivo il trapianto dei lobi timici colonizzati ha dimostrato inoltre che anche tegli progenie maturo di E13 e E18 TSP hanno differenti proprietà biologiche in vivo. TSP dalla prima ondata rapidamente generano cellule T, ma danno origine a un basso numero di cellule αβ e γδ T. Tra questi ultimi abbiamo rilevato dendritiche cellule epiteliali Vγ5Vδ1 T (detc), che hanno un TcR invariante, migrano verso l'epidermide in cui esercitano una funzione nella guarigione delle ferite e sono prodotti solo durante lo sviluppo embrionale 10. Al contrario, TSP dalla seconda ondata richiede tempo maggiore per generare un numero elevato di cellule TcR + T e non sono in grado di generare DETC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Due saggi principali possono essere utilizzati per analizzare differenziazione delle cellule T ex vivo. Il più recentemente riportato è il co-coltura di progenitori emopoietici con cellule stromali BM, OP9, esprimendo i ligandi di Noth1, delta come 1 o 4 12. Questo test 2-D è facile da eseguire, altamente efficiente e sensibile, permettendo analisi a livello di singola cellula. Tuttavia, esso non sostiene lo sviluppo delle cellule T oltre lo stadio di DP né la generazione di γδ DETC 13,</s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supportato da l'Istituto Pasteur, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant 'linfopoiesi'), il REVIVE futuro programma di investimenti e "La Ligue contre le Cancer".
Materials
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak. | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility Actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility Actions |
| Ketamine 100mg/ml (stock solution) | MERIAL | - | Anesthesic |
| Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution | AXIENCE | - | Morphinic analgesic |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | - | Eyes protection |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fœtal Calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and Streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2 b mercapto ethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1×270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
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