胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング<em>インビボ</em>と<em>インビトロ</em>アッセイ
Summary
This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.
Abstract
胸腺沈降前駆細胞を特徴づけることはリンパ球減少患者におけるT細胞の交換のための戦略を考案することが不可欠、T細胞の発達の前胸腺の段階を理解することが重要です。我々は、in vitroおよびin vivo技術 、「ハンギングドロップ」法に基づいて、両方の中の相補的な2によってマウス胚13日目と18胸腺から前駆細胞を沈降胸腺を検討しました。この方法は、その子孫以下こうしてCD45アロタイプマーカーとで区別E13および/またはE18胸腺前駆細胞を照射した胎児胸腺葉に定着させました。混合集団との植民地は、人口のいずれかでのコロニー形成が可能で競争力のある選択圧を除去しながら、前駆細胞の生物学的性質の細胞自律的な差異を分析することができます。植民地化胸腺葉はまた、Tの人口動態などのin vivoでの成熟T細胞子孫の分析可能にする免疫不全の雄レシピエントマウスに移植することができます彼異なる組織や器官の末梢免疫系と植民地化。胎児胸腺器官培養物を、E13前駆細胞はすべてに急速に発展し、CD3 +細胞に成熟することを明らかにした樹状上皮T細胞として知られている標準的なγδのT細胞サブセット、を生じました。対照的に、E18の前駆細胞は分化遅延を有し、樹状上皮T細胞を生成することができませんでした。 / – –胸腺移植されたCD3の末梢血のモニタリングマウスはさらにE18の胸腺沈降前駆細胞は、時間の経過とともに、短期的胎児胸腺に理解することができなかった機能をそのE13の対応よりも成熟T細胞のより大きな数を生成することを示しました器官培養。
Introduction
Tリンパ球は、αβまたはγδT細胞受容体（TCR）を有する、特殊な器官における胸腺を区別する。十分に発達した胸腺は、2つの異なる領域で構成されています。生産性のTCRβおよびα鎖遺伝子を再配置胸腺細胞がプログラム死（正の選択として知られるプロセス）から救出された胸腺前駆細胞の開発皮質、および;自己リガンドに強すぎる反応性を有する胸腺細胞を選択した髄質は、（負の選択）1,2削除されます。胸腺は、後に間葉細胞3に囲まれている第三の咽頭嚢の内胚葉層に由来します。これは、胎生E12から始まる造血前駆細胞が定着され、その後、連続的な動員は、通常のT細胞の発生4に必要とされます。胸腺の移民が開始され、厳密に調節されたプログラムによって編成、連続した発達段階を経て進化し、舞そのリガンドとの相互作用時に胸腺細胞のNotchシグナル伝達経路の活性化によってntained、4のようなデルタ、胸腺上皮細胞（のTEC）上に発現5。
胸腺細胞の開発は、いわゆるCD4で始まる– CD8 –ダ ブルネガティブ（DN）の段階。 、DN2（CD25 + CD44 +）、DN3（CD25 + CD44 – ）とDN4（CD25 – CD44 – ） – DN胸腺細胞は、さらにDN1（CD44 + CD25）へのCD25およびCD44の発現に応じて分割することができます。 CD24（HSA）およびCD117（c-キット）をさらにDN1aとbが早期胸腺前駆細胞（ETP）に対応する5サブセットにDN1区画を細分化。胸腺細胞は、DN段階でのTcRδ、βおよびα鎖の配置を変更し、前のTCR選択（DN3-DN4ステージを）受けます。のTCRα鎖は、正と負のSELEの前に並べ替えて、CD4 + CD8 +ダブルポジティブ（DP）区画への彼らは、さらにトランジットction。この段階では、ほとんどの胸腺細胞は排除され、わずかな割合（3〜5％）は、CD4 +またはCD8 + T細胞コンパートメント成熟到達します。
リンパ分化経路は、多能前駆細胞（MPP）と赤血球と巨核球6の可能性を失ったリンパプライミング多能性前駆細胞（LMPP）を生成するHSCの段階を経て進行します。 （C-キット（CD117）の発現、SCA-1とのFlt3 / Flk2は（CD135）およびインターロイキンの検出可能なレベルの不在– LMPPは、表現型（林は、系統が負）分化した血液細胞マーカーの不在によって定義されていますIL）-7受容体α鎖（IL-7RαまたはCD127）。 LMPPsはさらにその段階によって、骨髄細胞を生成する能力を失っていることを共通のリンパ系前駆細胞（CLP）7へと分化します。 CLPは、リンパ球（B細胞およびT細胞）、NK細胞、DCおよび先天性リンパ系細胞（ILC）の可能性を保持し、CD1の発現によりLMPP異なります27とSCA-1の高レベルの不在。
前駆細胞を沈降胸腺（TSP）の性質は広範囲に8を議論されてきたが、それは開発9を通じて、TSP変更表現型、分化能および機能ことが最近明らかになりました。我々は、E13（第一波）またはE18（第2波）のいずれかからFACS選別細胞による孤立し、TSPを特徴づけるために、in vitroおよびin vivoアッセイを行いました。異なるアロタイプマーカーを有するE13とE18前駆細胞の同数の植民地照射胸腺葉を持つ胎児胸腺器官培養（FTOC）は、同様の発達の環境でそれらの子孫以下の許可および前駆細胞の両方のタイプの間で異なる細胞固有の特性を明らかにしました。 E13やE18 TSPのいずれかによって植民地化胸腺ローブが原因で両方の前駆体との間の競合に選択せずに開発を可能にした。コロニー形成胸腺葉のインビボ移植、さらにまた、Tことが示されました彼は、 インビボで異なる生物学的特性を有するE13とE18 TSPの子孫を成熟します。最初の波からのTSPは、急速にT細胞を生成するが、αβおよびγδT細胞の数が少ないを生じさせます。後者の中、私たちは不変TCRは、それらは創傷治癒における機能を発揮し、唯一の胚発生の10の間に生成され、表皮に移行していVγ5Vδ1樹状上皮T細胞（DETC）を検出しました。対照的に、第二波のTSPは、TCR + T細胞の高い数を生成するために時間がかかり、DETCを生成することができません。
Protocol
Representative Results
Discussion
二つの主なアッセイは、ex vivoでのT細胞分化を分析するために使用することができます。最も最近報告Noth1、1または4〜12のようなデルタのリガンドを発現し、OP9 BMストローマ細胞と造血前駆細胞の共培養である。この2-Dアッセイは、実施が容易で、非常に効率的で敏感であり、可能分析で単一細胞レベル。しかし、いずれも、胸腺上皮との直接的な相互作用を必要とし、どちら…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
パスツール研究所、INSERM、アジャンス国立デRECHERCHE ANR（グラント「リンパ球」）、REVIVE今後の投資計画と「contreルがんラ·リーグ」でサポートされています。
Materials
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak. | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility Actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility Actions |
| Ketamine 100mg/ml (stock solution) | MERIAL | - | Anesthesic |
| Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution | AXIENCE | - | Morphinic analgesic |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | - | Eyes protection |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fœtal Calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and Streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2 b mercapto ethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1×270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
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