Karakterisering av Thymus- Bosetting stamfedre i Mouse Embryo hjelp<em> I Vivo</em> Og<em> In Vitro</em> Analyser
Summary
This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.
Abstract
Karakteriserer tymiske bosetting stamfedre er viktig å forstå de pre-thymic stadier av T-celle utvikling, avgjørende for å utarbeide strategier for T-celle utskifting i lymphopenic pasienter. Vi studerte tymisk settling progenitorer fra murine embryoniske dag 13 og 18 thymus ved to komplementære in vitro og in vivo teknikker, begge basert på "hengende dråpe" -metoden. Denne metoden tillot kolon bestrålte foster tymiske lapper med E13 og / eller E18 tymiske progenitors preget av CD45 allotypic markører og dermed følge deres avkom. Kolonisering med blandede bestander lar analysere cellestyrte forskjeller i biologiske egenskapene til forfedrene mens kolonisering med enten befolkningen fjerner mulige konkurranse selektive press. De koloniserte tymiske fliker kan også bli podet på immunsvikt hann resipientmus tillater analyse av modne T-celle-avkom in vivo, slik som populasjonsdynamikk tHan perifere immunsystemet og kolonisering av forskjellige vev og organer. Foster tymiske organkulturer viste at E13 forfedre utviklet seg raskt til alle modne CD3 + celler og ga opphav til den kanoniske γδ T-celle undergruppe, kjent som dendrittiske epitelceller T-celler. Til sammenligning E18 stamceller er en forsinket differensiering og var ikke i stand til å generere dendrittiske epithelial T-celler. Overvåkingen av perifert blod fra thymus-podet CD3 – / – mus viste videre at E18 tymisk avsetnings progenitorceller generere, med tiden, større antall modne T-celler enn sine motstykker E13, en funksjon som ikke kunne bli verdsatt på kort sikt fetal tymisk orgel kulturer.
Introduction
T-lymfocytter, bærer αβ eller γδ T-celle reseptor (TcR), skille i et spesialisert organ, thymus. Det fullt utviklet thymus er organisert i to forskjellige regioner: cortex, der thymic forfedre utvikle og hvor tymocytter at produktivt omorganisere TCR β og α kjede gener blir reddet fra programmert død (en prosess som kalles positiv seleksjon); og medulla, hvor valgt thymocyttene med for sterk reaktivitet til selv ligander slettes (negativ seleksjon) 1,2. Thymus stammer fra endodermal laget av det tredje faryngeale posen som senere omgitt av mesenchymale celler 3. Det er kolonisert av blodkreft stamceller som starter på embryonale dag E12, og deretter blir kontinuerlig rekruttering nødvendig for normal T celle utvikling 4. Tymiske innvandrere utvikle seg gjennom suksessive utviklingsstadier, orkestrert av et tett regulert program, initiert og maintained ved aktivering av Notch signalveien på thymocytter ved interaksjon med dets ligand, delta som 4, uttrykt på tymiske epitel-celler (TECS) 5.
Thymocytt utvikling starter på den såkalte CD4 – CD8 – double negative (DN) stadier. DN thymocyttene kan videre deles i henhold til uttrykk av CD25 og CD44 inn DN1 (CD25 – CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) og DN4 (CD25 – CD44 -). CD24 (HSA) og CD117 (c-Kit) subdivides videre DN1 rommet i fem undergrupper hvor DN1a og b tilsvarer tidlige tymiske stamfedre (ETP). Thymocyttene omorganisere TCR δ, β og α kjedene på DN scenen og gjennomgå forhånds TcR utvalg (DN3-DN4 etapper). De videre transitt til CD4 + CD8 + dobbel positive (DP) rommet der TcR α-kjeden ordner før positive og negative seleDette skjer. På dette stadiet fleste thymocytter elimineres, og bare en liten prosentandel (3-5%) når CD4 + eller CD8 + T-celle modne rommet.
Lymfoid differensiering pathway skrider gjennom stadier av HSCs som genererer multipotente stamceller (MPP) og lymfoid-primet multipotente stamceller (LMPP) som mistet erytrocytt og megakaryocytt potensial 6. LMPP er definert fenotypisk ved fravær av differensierte blodcellemarkører (avstamning negativ, Lin -), ekspresjon av c-kit (CD117) SCA-1 og Flt3 / Flk2 (CD135) og fravær av påvisbare nivåer av interleukin ( IL) -7-reseptor α kjede (IL-7rα eller CD127). LMPPs ytterligere differensiere til felles lymfoide stamfedre (CLP) 7 som på det stadiet har mistet evnen til å generere myeloide celler. CLP beholder lymfocytt (B og T-celle), NK-celle, DC og medfødt lymfoid celle (ILC) potensial, og skiller seg fra LMPP ved ekspresjon av CD127 og fraværet av høye nivåer av Sca-1.
Selv om arten av de thymus-settling progenitorceller (TSP) har blitt grundig diskutert 8, ble det nylig klart at TSP forandring fenotype, differensiering potensial og funksjon, hele utviklingen 9. Vi har utført in vitro og in vivo, for å karakterisere TSP, isolert ved hjelp av FACS-cellesortering enten fra E13 (første bølge) eller E18 (andre bølge). Foster tymiske organkulturer (FTOC) med bestrålte tymiske lapper kolonisert av like mange E13 og E18 stamfedre, som bærer ulike allotypic markører, tillatt etter deres avkom i en lignende oppvekstmiljø og avslørt celle iboende egenskaper, ulike mellom begge typer stamfedre. Tymiske fliker kolonisert av enten E13 eller E18 TSP lov utvikling uten valg på grunn av konkurranse mellom begge stamfedre. In vivo transplantasjon av de koloniserte thymic fliker videre viste at også than moden avkom av E13 og E18 TSP har ulike biologiske egenskaper in vivo. TSP-ene fra den første bølgen raskt generere T-celler, men gir opphav til lavt antall αβ og γδ T-celler. Blant de sistnevnte vi har oppdaget Vγ5Vδ1 dendrittiske epitelceller T-celler (DETC), som har en invariant TcR, migrere til epidermis der de utøver en funksjon i sårheling og er kun produsert under embryonal utvikling 10. I kontrast, TSP fra den andre bølgen tar lengre tid for å generere et høyt antall TcR + T-celler og er ikke i stand til å generere DETC.
Protocol
Representative Results
Discussion
To hoved analyser kan anvendes for å analysere T-celledifferensiering ex vivo. Den mest rapporterte nylig er co-kulturen i hematopoetiske stamceller med BM stromaceller, OP9, uttrykker ligander av Noth1, delta som en eller fire 12. Dette er 2-D-analysen enkel å utføre, svært effektiv og følsom, slik analyse på celle-nivå. Men støtter det verken T-celle utvikling utover scenen av DP eller generering av γδ DETC 13, som begge krever direkte samhandling med thymic epitel.
<p clas…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støttet av Pasteur Institute, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant 'Lymphopoiesis'), REVIVE Future Investment Program og "La Ligue contre le Cancer".
Materials
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak. | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility Actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility Actions |
| Ketamine 100mg/ml (stock solution) | MERIAL | - | Anesthesic |
| Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution | AXIENCE | - | Morphinic analgesic |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | - | Eyes protection |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fœtal Calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and Streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2 b mercapto ethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1×270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
- Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
- Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
- Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
- Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
- Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).
