Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em> In Vivo</em> E<em> In Vitro</em> Os ensaios
Summary
This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.
Abstract
Caracterização do timo resolver progenitores é importante compreender as fases de pré-timo de desenvolvimento de células T, essencial para elaborar estratégias de substituição de células T nos pacientes linfopênicos. Foram estudados timo decantação progenitores de murídeo dia embrionário 13 e 18 por dois timos complementar in vitro e in vivo técnicas, ambos com base no método "gota em suspensão". Este método permitiu colonizar lobos do timo fetal irradiados com E13 e / ou E18 progenitores timo distinguidos por CD45 marcadores alotípicos e, portanto, após a sua progênie. A colonização com populações mistas permitem analisar as diferenças celulares autônomos em propriedades biológicas dos progenitores enquanto colonização tanto com população remove possíveis pressões seletivas competitivos. Os lobos do timo colonizados também podem ser enxertados em ratos imunodeficientes beneficiários do sexo masculino que permitam a análise da progênie de células T maduras in vivo, tais como a dinâmica populacional de tele periféricos do sistema imunitário e colonização de diferentes tecidos e órgãos. Culturas de órgãos timo fetal revelou que progenitores E13 desenvolveu-se rapidamente a toda a amadurecer células CD3 + e deu origem ao subconjunto de células T γδ canônica, conhecidas como células T epiteliais dendríticas. Em comparação, os progenitores E18 tiver uma diferenciação retardada e não foram capazes de gerar células epiteliais dendríticas T. A monitorização do sangue periférico de enxertados do timo CD3 – / – ratos mostraram também que progenitoras E18 tímico sedimentação gerar, com o tempo, um maior número de células T maduras do que as suas contrapartes E13, uma característica que não pode ser apreciado no timo fetal de curto prazo culturas de órgãos.
Introduction
Linfócitos T, tendo o αβ ou o receptor de células T γδ (TCR), em diferenciar um órgão especializado, o timo. O timo totalmente desenvolvido está organizado em duas regiões distintas: o córtex, onde progenitores timo desenvolver e onde timócitos que produtivamente reorganizar a β TcR e genes da cadeia α são resgatados da morte programada (um processo conhecido como seleção positiva); e da medula, onde selecionado timócitos com demasiado forte reatividade a auto-ligantes são excluídos (seleção negativa) 1,2. O timo tem origem a partir da camada endodérmica do terceiro bolsa faríngea posterior que está rodeado por células mesenquimais 3. Ele é colonizada por células progenitoras hematopoiéticas a partir de dia embrionário E12 e, depois disso, o recrutamento contínua é necessária para o desenvolvimento das células T normais 4. Imigrantes timo evoluir através de sucessivos estágios de desenvolvimento, orquestrada por um programa bem regulamentado, iniciado e maintained pela activação da via de sinalização de Notch em timócitos após interacção com o seu ligando, como Delta 4, expressa em células epiteliais tímicas (TEC) 5.
Desenvolvimento de timócitos começa no chamado CD4 – CD8 – (DN) estágios dupla negativos. Timócitos DN pode ser subdividida de acordo com a expressão de CD25 e CD44 em DN1 (CD25 – CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) e DN4 (CD25 – CD44 -). CD24 (HSA) e CD117 (c-Kit) subdivide ainda mais o compartimento DN1 em cinco subconjuntos onde DN1a e b correspondem aos progenitores timo primeiros (PTE). Timócitos reorganizar as δ, β e α cadeias de TCR na fase DN e passam por pré-seleção TcR (estágios DN3-DN4). Eles ainda mais trânsito para o compartimento duplo positivo (DP) CD4 + CD8 +, onde a cadeia α TcR reorganiza antes da sele positivo e negativoction. Nesta fase, a maioria dos timócitos são eliminadas e apenas uma pequena percentagem (3-5%) chegar ao CD4 + ou CD8 + T maduras compartimento da célula.
A via de diferenciação linfóide progride através dos estágios de HSCs que geram progenitores multipotentes (MPP) e progenitores multipotentes ferrado-linfóides (LMPP) que perderam o eritrócitos e megakaryocyte potencial 6. LMPP são fenotipicamente definida pela ausência de marcadores celulares no sangue diferenciadas (linhagem negativa, Lin -), a expressão de c-Kit (CD117), Sca-1 e Flt3 / Flk2 (CD135) e a ausência de níveis detectáveis de interleucina ( IL) -7 receptor α cadeia (IL-7rα ou CD127). LMPPs diferenciar ainda mais em progenitores comuns linfóides (CLP) 7 que por essa fase perderam a capacidade de gerar células mielóides. CLP reter de linfócitos (células T e B), células NK, células linfóide e DC inata (ILC) potencial, e diferem de LMPP pela expressão de CD127 e a ausência de níveis elevados de Sca-1.
Embora a natureza dos timo resolver progenitores (PTS) tem sido amplamente debatido 8, tornou-se recentemente claro que a mudança TSP fenótipo, potencial e função de diferenciação, ao longo do desenvolvimento 9. Foram realizadas in vitro e in vivo em ensaios para caracterizar o TSP, isolado por separação de células a partir de FACS ou E13 (primeira onda) ou E18 (segundo grupo). Fetais culturas de órgãos timo (FTOC) com lobos do timo irradiados colonizados por um número igual de E13 e E18 progenitores, tendo diferentes marcadores alotípicos, autorizada após sua progênie em um ambiente de desenvolvimento semelhantes e revelou propriedades intrínsecas celulares, diferentes entre ambos os tipos de células progenitoras. Lobos do timo colonizados por qualquer E13 ou E18 TSP permitiu o desenvolvimento sem seleção devido à concorrência entre ambos os progenitores. In vivo transplante dos lobos do timo colonizados revelou ainda que também tele progênie madura de E13 e E18 TSP têm diferentes propriedades biológicas in vivo. TSPs da primeira onda gerar rapidamente as células T, mas dar origem a baixos números de células T γδ e αβ. Entre estes últimos foram detectados Vγ5Vδ1 células epiteliais dendríticas T (DETC), que têm um TcR invariante, migrar para a epiderme onde exercem uma função na cicatrização de feridas e só são produzidos durante o desenvolvimento embrionário 10. Em contraste, TSP a partir da segunda onda demorar mais tempo para gerar números elevados de células T + TcR e são incapazes de gerar DETC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dois ensaios principais podem ser usadas para analisar a diferenciação de células T ex vivo. O mais recentemente relatada é a co-cultura de células progenitoras hematopoiéticas, com células estromais da BM, OP9, expressar os ligandos de Noth1 delta, como 1 ou 4 12. Este ensaio de 2-D é fácil de executar, altamente eficientes e sensíveis, permitindo a análise o nível de uma única célula. No entanto, isso nem apoia o desenvolvimento de células T além da fase de DP nem a geração de γ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Compatível com o Instituto Pasteur, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant 'Linfopoiese'), a REVIVE Programa de Investimento e Futuro "La Ligue contre le Cancer".
Materials
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak. | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility Actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility Actions |
| Ketamine 100mg/ml (stock solution) | MERIAL | - | Anesthesic |
| Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution | AXIENCE | - | Morphinic analgesic |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | - | Eyes protection |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fœtal Calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and Streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2 b mercapto ethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1×270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
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