Характеристика тимуса Поселившись предшественников у эмбрионов мышей, используя<em> В Vivo</em> И<em> In Vitro</em> Анализы
Summary
This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.
Abstract
Характеризуя тимуса урегулирования предшественники важно понять заранее тимуса этапы развития Т-клеток, важно разработать стратегии для замены Т-клеток в lymphopenic пациентов. Мы изучили тимуса осаждения предшественников из мышиных эмбриональных день 13 и 18 thymi двумя дополнительными в пробирке и в естественных методов, как на основе метода "висячей капли". Этот метод позволил колонизации облученных плода тимуса долей с E13 и E18 / или тимуса предшественников отличаются CD45 allotypic маркеров и таким образом их потомства следующие. Колонизация смешанным населением позволяет анализировать клетки автономные различия в биологических свойств клеток-предшественников, а колонизация или населения удаляет возможные конкурентные давление отбора. Колонизированных тимуса долей также могут быть привиты в иммунодефицитных мышей-самцов-реципиентов, позволяющих анализа зрелого Т-клеток потомства в естественных условиях, например, динамики популяций Тон периферической иммунной системы и колонизации различных органов и тканей. Эмбриональные тимуса культуры органов показало, что E13 предшественники быстро превратился всех зрелых CD3 + клеток и привело к канонической подмножества γδ Т-клеток, известный как дендритные эпителиальные Т-клеток. Для сравнения, E18 предшественники имеют отсроченный дифференциации и были не в состоянии генерировать дендритные эпителиальные Т-клетки. Контроль периферической крови тимуса привитым CD3 – / – мышей показали также, что Е18 тимуса отстойные предшественники генерации, со временем, большее число зрелых Т-клеток, чем их коллеги E13, особенность, которая не может быть оценена в краткосрочной перспективе тимуса плода органов культуры.
Introduction
Т-лимфоциты, несущие на αβ или γδ T-клеточный рецептор (TCR), дифференцироваться в специальный орган, тимус. Полностью разработан тимус состоит из двух отдельных регионов: коры, где тимуса предшественники развивать и где тимоциты, что продуктивно переставить TCR β и α генов цепи спасенных от запрограммированной смерти (процесс, известный как позитивной селекции); и мозговое вещество, где выбрана тимоцитов слишком сильной реактивности самоуправлениям лигандов удаляются (негативный отбор) 1,2. Тимуса происходит из эндодермы слоем третьего глотки мешок, который позже в окружении мезенхимальных клеток 3. Это колонизирована гемопоэтических клеток-предшественников, начиная с эмбриональный день E12 и, после этого, непрерывный набор необходимого для развития Т-клеток нормального 4. Тимуса иммигранты развиваться через последовательные стадии развития, организованы жестко регулируется программе, инициированной и почтаntained по активации сигнального пути Notch на тимоцитов при взаимодействии с его лигандом, дельта, как 4, экспрессируется на эпителиальных клетках тимуса (ТИК) 5.
Развитие тимоцитов начинается в так называемой CD4 – CD8 – дважды отрицательный (DN) этапов. DN тимоцитов может быть далее подразделены в соответствии с выражением CD25 и CD44 в DN1 (CD25 – CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) и DN4 (CD25 – CD44 -). CD24 (HSA) и CD117 (с-Kit), дополнительно подразделяет отсек dN1 в 5 подмножеств, где DN1a и б соответствуют ранних предшественников тимуса (ETP). Тимоциты переставить TCR δ, β и α цепей на стадии DN и пройти предварительную TCR выбор (DN3-DN4 стадии). Они также транзит в CD4 + CD8 + двойной положительный (ДП) отсеке TcR α цепь переставляет до положительного и отрицательного Селеие. На этом этапе большинство тимоцитов устранены, и лишь небольшой процент (3-5%) достигают CD4 + или CD8 + Т-клеток зрелых отсек.
Лимфоидной дифференциация путь проходит через этапы, которые генерируют ГСК мультипотентные предшественники (MPP) и лимфоидных грунтовка мультипотентные предшественники (LMPP), которые потеряли эритроцитов и мегакариоцитов потенциальную 6. LMPP фенотипически определяется отсутствием дифференцированных клеток крови маркеров (род отрицательным, Лин -), выражение с-Kit (CD117), SCA-1 и Flt3 / Flk2 (CD135) и отсутствие заметных уровней интерлейкина ( Иллинойс) -7-рецептор α цепи (ИЛ-7rα или CD127). LMPPs дальнейшей дифференциации в общих лимфоидных клеток-предшественников (CLP) 7, которые на этом этапе потеряли способность генерировать миелоидных клеток. CLP сохранить лимфоцитов (B и Т-клетки), NK клетки, DC и врожденная лимфоидной клетки (ILC) потенциал, и отличаются от LMPP по выражению CD127 и отсутствие высоких уровней SCA-1.
Хотя природа тимуса урегулирования предшественников (TSP) был широко обсуждается 8, стало ясно, что в последнее время ТСП изменение фенотипа, дифференциация потенциал и функция, на протяжении развития 9. Мы выступали в пробирке и в естественных условиях анализов для характеристики ПБО, изолированных на FACS сортировки клеток или от E13 (первая волна) или E18 (вторая волна). Эмбриональные тимуса культуры органов (FTOC) с долей тимуса облученных колонизированных равных чисел E13 E18 и предшественников, несущих различные маркеры allotypic, разрешенных после их потомства в аналогичной среде развития и выявленных внутренние свойства клеток, различные между двумя типами клеток-предшественников. Тимуса долей, колонизированных или E13 или E18 TSP позволило развитие без выбора из-за конкуренции между двумя предшественников. В естественных условиях трансплантация колонизированных тимуса долях показали также, что также тон зрелый потомство E13 E18 и ТСП имеют различные биологические свойства в естественных условиях. TSPS от первой волны быстро генерировать Т-клетки, но приводят к низкой численности αβ и γδ Т-клеток. Среди последних мы обнаружили Vγ5Vδ1 дендритные эпителиальные клетки Т (DETC), которые имеют инвариант TcR, мигрируют в эпидермис, где они оказывают функцию в заживлении ран и производятся только во время эмбрионального развития 10. В отличие от этого, ТСП от второй волны занять больше времени, чтобы произвести большое число TcR + Т-клеток и не в состоянии генерировать DETC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Две основные анализы могут быть использованы для анализа Т-клеток дифференциации экс виво. Недавно сообщил в совместное культивирование гемопоэтических клеток-предшественников с стромальных клеток, OP9, выражая лиганды Noth1, дельта, как 1 или 4 12. Этот 2-D анализа легко выполнить…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддерживается в Институте Пастера, INSERM, Национальное агентство по исследованиям ANR (Гранта "лимфопоэза"), возродить инвестиционной программы будущего и "La Ligue CONTRE ле рака".
Materials
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak. | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility Actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility Actions |
| Ketamine 100mg/ml (stock solution) | MERIAL | - | Anesthesic |
| Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution | AXIENCE | - | Morphinic analgesic |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | - | Eyes protection |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fœtal Calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and Streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2 b mercapto ethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1×270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
- Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
- Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
- Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
- Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
- Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).
