Karakterisering av Thymic Settling stamfäder i Mouse Embryo Använda<em> In Vivo</em> Och<em> In Vitro</em> Analyser
Summary
This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.
Abstract
Kännetecknande tymiska lösa stamceller är viktigt att förstå de pre-tymiska stadier av T-cellsutveckling, viktigt att utarbeta strategier för T-cellersättning i lymfopen patienter. Vi studerade tymus lösa stamceller från mus embryonala dag 13 och 18 Thymi med två kompletterande in vitro och in vivo-tekniker, båda baserade på "hängande drop" -metoden. Denna metod får kolonisera bestrålade foster tymiska lober med E13 och / eller E18 tymiska stamceller kännetecknas av CD45 allotypiska markörer och därmed efter deras avkomma. Colonization med blandade populationer tillåter analysera cell autonoma skillnader i biologiska egenskaper hos föregångare när kolonisering med antingen befolkning bort eventuella konkurrensselektionstryck. De koloniserade tymiska lober kan också ympas i immunodeficienta manliga recipientmöss möjliggör analys av den mogna T-cell avkomma in vivo, såsom populationsdynamik av than perifera immunsystemet och kolonisering av olika vävnader och organ. Fostrets tymiska kulturer organ visade att E13 gångare utvecklades snabbt till alla mogna CD3 + celler och gav upphov till den kanoniska γδ T-cellgrupp, som kallas dendritiska epitelceller T-celler. I jämförelse, E18 stamceller har en fördröjd differentiering och kunde inte generera dendritiska epitel T-celler. Övervakningen av perifert blod från tymus-ympade CD3 – / – möss visade dessutom att E18 tymus sedimenterings progenitorer genererar, med tiden, ett större antal mogna T-celler än deras E13 motsvarigheter, en funktion som inte kan uppskattas på kort sikt fetal tymus organkulturer.
Introduction
T-lymfocyter, som bär αβ eller γδ T-cellsreceptor (TCR), skilja på en specialiserad organ, bräss. Den fullt utvecklade bräss är organiserad i två skilda områden: hjärnbarken, där tymiska stamceller utvecklas och där tymocyter som produktivt ordna om TCR β och α kedjegener räddas från programmerad celldöd (en process som kallas positiv selektion); och märgen, där utvalda tymocyter med alltför stark reaktivitet mot självligander raderas (negativ selektering) 1,2. Tymus härstammar från endodermalt lagret av tredje svalg påse som senare omgiven av mesenkymala celler 3. Den är koloniseras av hematopoietiska progenitorer som startar vid embryonal dag E12 och därefter är kontinuerlig rekrytering krävs för normal T-cellutveckling 4. Tymiska invandrare utvecklas genom successiva utvecklingsstadier, iscensatt av en hårt reglerad program, initierat och maintained genom aktiveringen av Notch signaleringsvägen på tymocyter vid interaktion med dess ligand, deltaliknande 4, uttryckt på tymiska epitelceller (TEC) 5.
Tymocyt utveckling börjar vid den så kallade CD4 – CD8 – dubbel negativa (DN) steg. DN tymocyter kan ytterligare delas enligt uttrycket av CD25 och CD44 i DN1 (CD25 – CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) och DN4 (CD25 – CD44 -). CD24 (HSA) och CD117 (c-Kit) delar in ytterligare DN1 facket i 5 delmängder där DN1a och b motsvarar tidiga tymiska stamceller (ETP). Tymocyter ordna TCR δ, β och α kedjor i DN stadiet och genomgå pre-TcR urval (DN3-DN4 stadier). De ytterligare väg till CD4 + CD8 + dubbla positiva (DP) utrymme där TcR α-kedjan ordnar före positiv och negativ seleInsatser. I detta skede de flesta tymocyter elimineras och endast en liten andel (3-5%) når CD4 + eller CD8 + mogna T-cellfacket.
Den lymfoida differentieringsväg fortskrider genom de olika stadierna av HSCs som genererar multi progenitorceller (MPP) och lymfoid-primas multi stamceller (LMPP) som förlorat erytrocyter och megakaryocyter potential 6. LMPP är fenotypiskt definieras genom frånvaron av differentierade blodcellmarkörer (härstamning negativ, Lin -), ett uttryck av c-Kit (CD117), Sca-1 och Flt3 / FLK2 (CD135) och frånvaro av detekterbara nivåer av interleukin ( IL) -7 receptor α-kedjan (IL-7rα eller CD127). LMPPs ytterligare differentiera till gemensamma lymfoida stamceller (CLP) 7 som genom detta skede har förlorat förmågan att generera myeloidceller. CLP behålla lymfocyter (B och T-cell), NK-celler, DC och medfödd lymfoidcell (ILC) potential, och skiljer sig från LMPP av uttrycket av CD 127 och frånvaron av höga halter av Sca-1.
Även om arten av de tymiska sedimente progenitorer (TSP) har i stor utsträckning diskuterat 8 blev det nyligen klart att TSP förändring fenotyp, differentieringspotential och funktion, genom hela utvecklingen 9. Vi spelade in vitro och in vivo-analyser för att karaktärisera TSP, isoleras genom FACS cellsortering från antingen E13 (första vågen) eller E18 (andra vågen). Fostrets tymiska organkulturer (FTOC) med bestrålade tymiska lober koloniserades av lika många E13 och E18 progenitorceller, bärande olika allotypiska markörer, tillåts följa deras avkomma i en liknande utvecklingsmiljö och avslöjade cell inneboende egenskaper, olika mellan de båda typerna av stamceller. Tymiska lober koloniserades av antingen E13 eller E18 TSP tillåtna utveckling utan val på grund av konkurrensen mellan de båda stamfäder. In vivo transplantation av de koloniserade tymiska lober visade vidare att även than mogen avkomma av E13 och E18 TSP har olika biologiska egenskaper in vivo. Tsk från den första vågen snabbt generera T-celler, men ger upphov till låga antalet αβ och γδ T-celler. Bland de senare vi upptäckt Vγ5Vδ1 dendritiska epitelceller T-celler (DETC), som har en invariant TcR, migrera till epidermis där de utövar en funktion vid sårläkning och endast tillverkas under fosterutvecklingen 10. Däremot TSP från den andra vågen tar längre tid att generera ett stort antal TcR + T-celler och är oförmögna att generera DETC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Två huvud analyser kan användas för att analysera T-celldifferentiering ex vivo. Den senast rapporterade är co-kultur av hematopoetiska stamceller med BM stromaceller, OP9, uttrycka ligander av Noth1, delta som 1 eller 4 12. Det är lätt att utföra, effektiv och känslig Detta 2-D-analys, vilket gör analysen på den enda cellnivå. Men varken stöder T-cellsutveckling bortom stadiet av DP eller generering av γδ DETC 13, som båda kräver direkta interaktioner med tymisk epitel. </…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Med stöd av Pasteurinstitutet, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant "Lymphopoiesis), den REVIVE Future Investment Program och" La Ligue contre le Cancer ".
Materials
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak. | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility Actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility Actions |
| Ketamine 100mg/ml (stock solution) | MERIAL | - | Anesthesic |
| Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution | AXIENCE | - | Morphinic analgesic |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | - | Eyes protection |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fœtal Calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and Streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2 b mercapto ethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1×270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
- Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
- Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
- Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
- Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
- Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).
