Détection de axonaux localisée ARNm dans les sections de cerveau en utilisant haute résolution<em> In Situ</em> Hybridation
Summary
RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.
Abstract
ARNm sont souvent localisées aux axones vertébrés et leur traduction locale est nécessaire pour pathfinding axone ou de branchement pendant le développement et pour l'entretien, la réparation ou la neurodégénérescence dans les périodes postdevelopmental. Analyses à haut débit ont récemment révélé que les axones ont un transcriptome plus dynamique et plus complexe que prévu. Ces analyses, mais ont été principalement fait dans des neurones en culture, où les axones peuvent être isolées à partir des compartiments de somato-dendritique. Il est pratiquement impossible de réaliser une telle isolation dans les tissus entiers in vivo. Ainsi, afin de vérifier le recrutement d'ARNm et leur pertinence fonctionnelle dans un animal entier, les analyses de transcriptome devraient idéalement être combinées avec des techniques qui permettent la visualisation des ARNm in situ. Récemment, de nouvelles technologies de l'ISH qui détectent ARN au niveau d'une seule molécule ont été développés. Ceci est particulièrement important lors de l'analyse de la localisation subcellulaire de l'ARNm, ARN depuis localisées se trouvent généralement à des niveaux faibles. Nous décrivons ici deux protocoles pour la détection des ARNm axonaux-localisées en utilisant une technologie ultrasensible nouvel ARN ISH. Nous avons combiné RNAscope ISH avec de contraste axonale par immunohistochimie de fluorescence ou des colorants histologiques de vérifier le recrutement de ATF4 ARNm aux axones in vivo chez la souris adulte et les cerveaux humains.
Introduction
Le recrutement d'ARNm axonale et la traduction locale permettent axones à répondre à des stimuli extracellulaires d'une manière temporellement et spatialement aiguë 1. La synthèse des protéines intra-axonal est mieux compris dans le contexte de développement neurologique où elle joue un rôle crucial dans la croissance cône comportement 8.2, 11.9 et des axones signalisation rétrograde 12,13. Mais loin en sait moins sur la signification fonctionnelle de la synthèse des protéines axonale dans les neurones post-développement lorsque les niveaux d'ARNm et de ribosome axonales sont considérablement réduits 14,15. Axones vertébrés matures ont longtemps été pensé pour être inactive translation 16. Cependant, des études récentes indiquent que la traduction locale est réactivé dans les axones matures dans des conditions pathologiques. Par exemple, un sous-ensemble des ARNm est recruté pour axones après une lésion du nerf et de la synthèse des protéines intra-axonal est nécessaire pour la régénération correcte de ces axones 17. En outre, notre ha de groupes a montré que les ARNm spécifiques sont recrutés pour des axones après une exposition locale à la maladie d'Alzheimer peptide Aß 1-42, et de la traduction locale ATF4 facteur de transcription est nécessaire pour propager les effets neurodégénératifs de Aß 1-42 de axones au soma neuronal 18. Enfin, les analyses à haut débit ont révélé que les axones matures ont un transcriptome plus complexe et dynamique que prévu 18-21, en particulier dans des conditions pathologiques. À la lumière de ces études, une méthode hautement sensible et spécifique pour détecter les ARNm axonaux localisées dans le système nerveux adulte est nécessaire.
Une grande partie du travail sur le recrutement de l'ARNm et la traduction locale dans les axones matures a été effectuée sur des neurones en culture. Cela est particulièrement vrai pour les analyses de transcriptome car les méthodes de culture spécialisés existent qui permettent l'isolement des axones de la somato-dendritique compartiment 18-20. Bien que ces études ont donné ins précieusesight dans le rôle de la traduction locale dans les axones matures, la question de savoir si des neurones en culture représentent fidèlement la situation in vivo ou si le recrutement ARNm est une réponse adaptative des axones à conditions de culture est toujours ouverte. Peu d'études ont fourni des preuves de recrutement d'ARNm de mûrir axones in vivo. Par exemple, la transcription codant pour la protéine de marquage olfactif a été détectée dans les axones des neurones sensoriels adultes 22. Un transgène contenant l'extrémité 3 'UTR de l'ARNm de β-actine est transporté vers les axones des neurones du système nerveux central et périphérique chez des souris et se traduit localement après 23 périodes de développement. Lamin de l'ARNm est localisée aux axones de la rétine dans Xenopues laevis têtards et son épuisement affecte l'entretien de l'axone après le développement des axones 21. Interférence avec le transport axonal de l'ARNm codant pour la cytochrome C oxydase IV modifie le comportement de la souris 24. Enfin, ATF4 ARNm se trouve dans un adulteXons des souris et des cerveaux humains dans le contexte de Aß 1-42 induite par la neurodégénérescence 18.
Analyses du transcriptome à haut débit se sont avérées utiles pour identifier les profils d'ARNm dans les axones isolés in vitro, mais avoir des limites pour des études in vivo depuis dans les tissus entiers axones ne se trouvent jamais dans l'isolement, mais entremêlées avec les organes de cellules neuronales, cellules gliales et d'autres types de cellules. Ainsi, de telles analyses doivent être combinées avec des techniques d'imagerie qui confirment la localisation subcellulaire des ARNm. Hybridation in situ de l'ARN (ARN ISH) en permet la détection et la visualisation des séquences d'ARN spécifiques dans les cellules et les tissus. Cependant, les tests ARN ISH originaux étaient conviennent que pour l'identification des ARN très abondantes 25, ce qui est rarement le cas pour les ARNm axonaux localisées. Pour les dernières décennies des efforts accrus ont été mis en développant de nouvelles technologies qui permettent la détection des ARNm au niveau d'une seule molécule <sup> 25,26. Par exemple, Singer et ses collègues ont mis au point des sondes ISH pour détecter des ARNm dans des cellules individuelles, consistant à 5 non-chevauchement marqué par fluorescence 50-mères (pour plus de détails se réfèrent à 27). La principale différence entre les techniques mentionnées ci-dessus et celle décrite ici est que le plus tard, utilise 20 à double Z-structure (pas linéaire) sondes qui ciblent typiquement ~ 1 kb région de l'ARN d'intérêt assurant la spécificité et faible niveau de fond. Les sondes sont ensuite hybridées avec préamplificateur et l'amplificateur des séquences qui sont finalement marqué par fluorescence ou conjugués avec des enzymes qui permettent des réactions chromogènes. Ces étapes d'amplification d'améliorer le rapport signal-bruit par rapport à d'autres technologies de ISH 28. Nous décrivons ici deux protocoles utilisant RNAscope associée, soit à fluorescence immunocytochimie ou avec des colorants histologiques permettant contre-coloration axonale. Les deux protocoles sont appropriés pour visualiser la localisation axonale des ATF4 ARNm dans mo adultesutiliser et les cerveaux humains.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce rapport, nous décrivons l'utilisation d'une technologie de ISH haute résolution dans la détection de l'ARNm axonaux localisée ATF4. Ces précédentes et les études publiées montrent que cette technologie est compatible avec la détection de protéines à base d'anticorps dans les tissus ou même des embryons entiers 33. Surtout, il a été récemment utilisée pour la détection de l'ARNm de l'arc à l'intérieur de dendrites des neurones de l'hi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Alzheimer’s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer’s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions
Materials
| custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | In situ hybridization kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit – BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | In situ hybridization kit |
| Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX mounting medium | Sigma | 6522 |
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