Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.
Adenocarcinoma ductal do pâncreas (PDAC) contém um subconjunto de células estaminais cancro exclusivamente tumorigénicas (CSCs) que foram mostrados para dirigir a iniciação do tumor, metástase e resistência à radio- e quimioterapia. Aqui nós descrevemos uma metodologia específica para a cultura de CSCs pancreáticas humanas primárias como esferas tumorais em condições independente de ancoragem. As células são cultivadas em condições não-aderentes isentas de soro, a fim de enriquecer para os CSCs enquanto suas progênies mais diferenciadas não sobrevivem e proliferam durante a fase inicial após a sementeira de células individuais. Este ensaio pode ser utilizado para estimar a percentagem de CSCs presentes numa população de células tumorais. Tanto o tamanho (que pode variar 35-250 micrómetros) e número de esferas tumorais formados representa a actividade de CSC abrigava tanto em populações em massa de células cancerosas em cultura ou recentemente colhidas e digeridos tumores 1,2. Utilizando este ensaio, verificou-se recentemente que a metformina ablates seletivamente pancreatic CSCs; uma descoberta que foi posteriormente confirmada pelos demonstrando expressão diminuída de genes / marcadores de superfície associada à pluripotência e reduziu em tumorigenicity vivo de células tratadas com metformina. Como etapa final para desenvolvimento pré-clínico que tratou ratinhos com tumores estabelecidos com metformina e encontrou sobrevivência significativamente prolongada. Os estudos clínicos que testam o uso de metformina em pacientes com PDAC estão actualmente em curso (por exemplo, NCT01210911, NCT01167738 e NCT01488552). Mecanicamente, descobrimos que a metformina induz a uma crise energética fatal em CSCs, aumentando a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e reduzir a potencial transmembrana mitocondrial. Em contraste, não-CSCs não foram eliminadas pelo tratamento com metformina, mas reversível foram submetidos a paragem do ciclo celular. Portanto, nosso estudo serve como um exemplo de sucesso para o potencial de formação in vitro esfera como ferramenta de triagem para identificar compostos que potencialmente alvo CSCs, mas esta técnica exige ainda mais in vitro e in vivo de validação para eliminar falsos descobertas.
Adenocarcinoma ductal do pâncreas (PDAC) é um dos tumores sólidos mais agressivos. É atualmente o 4º morte mais comum relacionada com o cancro na sociedade ocidental e está previsto para subir para a 2ª causa mais freqüente dentro da próxima década (~ 400 mil mortes por ano no mundo) 3 .No momento do diagnóstico de 90% dos pacientes apresentam com doença avançada, que tem uma sobrevivência de menos de 5% de 5 anos. Esta taxa de sobrevivência foi decepcionante manteve-se inalterada nos últimos 50 anos, apesar de as actividades de investigação cada vez mais intensivos 4. Dos restantes 10% dos pacientes que têm, potencialmente, a doença "curável" através de ressecção cirúrgica, 80% morrerão de reincidência no prazo de 5 anos. Por muitos anos o padrão de cuidados para a doença avançada tem sido monoterapia gemcitabina, mas isso só confere uma vantagem de sobrevivência marginal 5. Pequenas melhorias na sobrevivência a curto prazo foram alcançados pela adiçãode erlotinib 6 ou 7 capecitabina, no entanto, o benefício de sobrevivência é na ordem de semanas com a sobrevivência global mediana ainda ~ 6 meses. Recentemente, resultados mais encorajadores surgiram para gemcitabina / paclitaxel nab 8 ea combinação FOLFIRINOX regime 9,10. Estas terapias melhorar a sobrevida média por uns modestos 2 e 4 meses, respectivamente, mas são altamente tóxicos e sobreviventes a longo prazo ainda são uma rara exceção. Embora o tratamento oferece o potencial de melhoria, estes são regimes tóxicas a que muitos pacientes não respondem ou mostram apenas melhorias incrementais na sobrevida global. Como consequência, há uma necessidade urgente para complementar as terapias actuais e desenvolver novos, abordagens terapêuticas multimodais mais prováveis.
Tumor Heterogeneidade
É cada vez mais evidente que a heterogeneidade câncer não está confinada somente à distinta evolutiva subclones within cada tumor 11, mas também accionado por fenotípica e heterogeneidade funcional e plasticidade dentro de cada sub-clone 12. As chamadas células-tronco cancerosas (CSCs) ou células promotoras de tumor são responsáveis pela heterogeneidade intraclonal 13-16. Especificamente, CSCs representam um subconjunto de células de câncer, para que nós e outros forneceram evidências conclusivas, até a única célula, que representam a raiz da doença, dando origem a todas as progênies diferenciadas dentro de cada subclone câncer 17. Mais importante ainda, estas células são essenciais para o comportamento metastático e também representam uma fonte importante para a recidiva da doença após o tratamento, mesmo com drogas relativamente eficazes, capazes de induzir a regressão do tumor inicial (por exemplo, paclitaxel nab) 15,18-20. É importante notar que CSCs não representam necessariamente bona fide células-tronco, nem eles surgem a partir de células-tronco do tecido em muitos casos, mas eles têm acquired certas características das células-tronco. A maior parte destes são funcionalmente definidos, por exemplo CSCs estão equipados com a capacidade de auto-renovação indefinido o que os torna resistentes à quimioterapia convencional, e mostram aumento da capacidade de invasão, que promove a actividade metastática.
Os fenótipos funcionais células-tronco cancerígenas
O fenótipo funcional de CSCs é baseada na sua capacidade de se auto-renovar, que podem ser testados in vitro, utilizando a formação de esfera de série e ensaios de formação de colónia, respectivamente. Ainda mais importante, os CSCs capazes de auto-renovação urso em tumorigenicidade in vivo que podem ser testadas por diluição limitante em ensaios in vivo como a leitura funcional final, de preferência, durante o transplante de série exclusiva indicativo de tumorigenicidade de longo prazo. Além disso, existe uma grande heterogeneidade no interior do compartimento do CSC, com uma subpopulação distinta de CSCs ostentam a capacidade exclusiva para dar origem a metástases que não é apenas umconseqüência direta de sua exclusiva em tumorigenicity vivo. Na verdade, CSCs metastastitic adquirir a capacidade de iludir o tumor primário, anoikis sobreviver e, eventualmente, translocam e sementes locais secundários. Estas capacidades funcionais avançados podem ser ensaiados in vitro usando ensaios de invasão modificados e in vivo, utilizando ensaios de metástases.
Segmentação células-tronco cancerosas
Nós e outros forneceram evidências convincentes de que os tratamentos com foco na massa tumoral de células diferenciadas PDAC, mesmo em combinação com agentes de direccionamento do estroma, não têm um grande impacto sobre a progressão do tumor e resultado subsequente a menos que combinado com uma estratégia de segmentação CSC-21, 22. Assim, com base nas funções essenciais de CSCs na progressão da doença e resistência à terapia, estas células deve significar um componente essencial para qualquer nova abordagem de tratamento 18,20, mas irá exigir um conhecimento muito mais completa of a maquinaria reguladora de CSCs. Embora CSCs e suas progênies mais diferenciados suportar estados idênticos terra genéticas em relação a alterações genéticas, CSCs apresentam expressão genética distinta e, portanto, epigenetically determinado perfis que módulos share com células-tronco pluripotentes. A maioria dos genes envolvidos na geração de células-tronco pluripotentes induzidas (Nanog, OCT3 / 4, Klf4, Sox2) não só foram ligados ao câncer, mas a sua expressão é praticamente restrito ao compartimento de CSCs. Além disso, a relevância funcional dos CSCs por experiências de perda de função usando ferramentas genéticas para o direcionamento de CSCs já estabeleceu firmemente o conceito de CSC para vários tipos de câncer 23-25. Embora a maioria destas abordagens são baseadas em modelos de ratos e, portanto, não são facilmente transferíveis para a clínica, eles não fornecem prova-de-conceito para o potencial relevância clínica da segmentação CSCs em combinação com células tumorais em massa.
Estudando células-tronco cancerosas Em Vitro identificar seu calcanhar de Aquiles
A fim de identificar novos modos e clinicamente aplicável para o direccionamento CSCs, as suas características são regularmente estudada in vitro e a formação de esfera é amplamente utilizado neste contexto. Originalmente desenvolvido para o estudo de biologia das células estaminais normais, incluindo a auto-renovação e diferenciação da capacidade, este ensaio foi depois adaptado para estudar CSCs in vitro e tem sido utilizado para investigar os CSCs isoladas de PDAC 20. Descobrimos que as esferas tumorais formados a partir de células humanas primárias PDAC suportar todas as características distintas de CSCs, portanto, indicando que eles contêm bona fide 21 CSCs pancreáticas. Assim, o ensaio esfera tumor representa uma ferramenta poderosa para a tela para terapias mais eficazes in vitro, mas os resultados precisam ser melhor avaliadas em mais rigorosos ensaios in vivo. Com efeito, os dados gerados com este ensaio in vitro deverá ser tratado com grande cuidado, pois the ensaio pode ser sujeito a erros significativos. Protocolos altamente padronizados, incluindo contagem automatizada de esferas formadas, devem ser estabelecidos para garantir que os dados reprodutíveis e preditiva.
Neste contexto, recentemente utilizado este ensaio para a tela CSCs pancreáticas derivados de um conjunto diversificado de PDACs humanos primários e mostrou que estas células são altamente vulneráveis a reprogramação metabólica pela metformina composto anti-diabético. Anteriormente, tinha sido demonstrado metformina para inibir a expansão de células de cancro através da activação indirecta de quinase ativada por AMP proteína (AMPK) e a subsequente inibição de sinalização da mTOR 26, resultando na síntese de proteínas reduzida e a proliferação de células 27. Em adição a estes efeitos sobre a população de tumores grandes quantidades, nós e outros descobriram que a metformina é capaz de atacar e eliminar efectivamente a subpopulação CSCs numa série de tumores sólidos, tais como cancro da mama, cancro do esófago, o glioblastoma e o cancro do pâncreas 28-31 </ Sup>. Assim, a metformina representa uma nova estratégia terapêutica promissora e segura para vários tipos de câncer com necessidade médica não atendida atualmente. Além disso, utilizando a formação de esfera, como um meio de enriquecer para os CSCs, que mostrou que os efeitos primários da metformina sobre CSCs pancreáticas foi independente da activação de AMPK e confiou na sua toxicidade mitocondrial modesta (através da inibição do complexo I), o que aparentemente foi letal para o subconjunto de CSCs somente. Para este último, fomos capazes de avaliar o seu consumo de oxigênio e produção de ROS mitocondrial celular como indicadores de toxicidade da droga a nível celular. Posteriormente, esses dados in vitro poderia ser validados em modelos pré-clínicos de mouse e de fato resultou em 31 sobrevivência significativamente prolongada. A metodologia aqui apresentada permite a rápida geração de perfis de sensibilidade aos fármacos para os CSCs, incluindo estudos sobre os seus efeitos sobre o metabolismo do CSC. Nós agora fornecer prorrogado detalhes experimentais sobre o utilizado complementar in vitro e em procedimentos in vivo.
Com o surgimento e posterior validação do conceito de CSC para muitos tumores, o campo de desenvolvimento de medicamentos ganhou novo impulso, com o potencial para o desenvolvimento de tratamentos de câncer mais eficientes e, posteriormente, redução do risco de recidiva da doença. No entanto, o campo CSC ainda está em um estado precoce e mais precisa ser alcançado em termos de compreensão origem CSC e propagação, e seu papel na formação da arquitetura tumor e promovendo metástase.
Neste contexto, a utilização de ensaios de CSC e reprodutíveis significativos, bem como a interpretação de dados informado obtido representa um componente fundamental para o avanço da nossa compreensão da biologia CSC. A partir de muitas perspectivas biológica, formação esfera emergiu como um ensaio extremamente valioso; no entanto, os usuários devem estar cientes de suas limitações, a fim de interpretar corretamente os resultados experimentais. Um aspecto importante a considerar antes mesmo da avaliação da esfera formação de dados, é a origem da amostra investigada, uma vez que os resultados obtidos a partir de amostras frescas derivado de paciente pode ser significativamente diferentes dos obtidos a partir de linhas celulares de cancro estabelecidas.
Clássicos ensaios de formação envolvem a esfera sementeira de células a uma densidade clonal em placas de ultrabaixo-fixação e avaliar a formação esfera na presença de factor de crescimento epidérmico (EGF) e / ou factor de crescimento de fibroblasto básico (b-FGF) enriquecido, mas meio isento de soro de 21, 34. A composição do meio de cultura é também uma questão importante a considerar. Na nossa experiência verificou-se que o DMEM / F12 suplementado com B27, bFGF e glutamina na ausência de soro era um meio ideal para crescer, expandir-se e manter a CSC em condições indiferenciadas. Verificou-se que nestas condições de cultura (meio de suspensão e) as células expressam quantidades elevadas de marcadores de células estaminais do cancro (incluindo CD133 +, CD44 + e CD24 +) e não expressam proteínas associadas à diferenciação (CK-20 E CK-19).
Um dos pressupostos fundamentais para estes ensaios é que cada esfera é clonal, ou seja, uma esfera resulta da expansão de uma única célula-tronco. No entanto, as esferas são intrinsecamente estruturas dinâmicas que são propensas a se fundir, mesmo a baixa densidade de semeadura 35. Chapeamento de células é um passo crítico no protocolo ea densidade de uma célula / poço certamente pode contornar o problema de agregação. Mas mesmo para progenitores prospectivamente ordenadas, este regularmente resulta na formação de muito baixa esfera, devido à baixa actividade de formação de esfera intrínseca e também pode ser atribuída a estimulação autócrina limitado devido aos efeitos de diluição. Na nossa experiência, observou-se que apenas 30% das células plaqueadas são capazes de formar esferas. Recomenda-se também utilizar, pelo menos, 100 células / a obtenção de resultados consistentes e reproduzíveis.
Outros métodos de cultura para a CSC crescimento baseiam-se em culturas em 3D sólido ou semi-sólidos (por exemplo, com base em matrigel, colagénio ou metilcelulose). Estes métodos têm sido utilizados para limitar a mobilidade de células e agregação de células posterior 36. No entanto, cada uma dessas matrizes carrega as suas próprias limitações. Por exemplo, Matrigel é uma membrana basal solúvel isolado do Engelbreth-Holm-Swan (EHS) do tumor e, embora o extracto do tumor se assemelha ao ambiente extracelular complexo encontrada em muitos tecidos, que contém múltiplos factores de crescimento mais ou menos bem definidos, que muitas vezes presta mecanicista estudos para elementos reguladores específicos muito difícil. Outro ponto de consideração é que as funções das células-tronco de capacidades e de formação de esfera não são termos intercambiáveis 34. Enquanto certas células estaminais e progenitoras têm mostrado exibir falha de formação de esfera capacidade de 37, para gerar in vitro esferas não exclui função in vivo tronco / progenitoras. Por exemplo, as células estaminais quiescentes simplesmente não podem responder aos estímulos extracelulares previstos pelaseleccionado em condições de cultura in vitro. Assim, a longo prazo in vitro e na capacidade de auto-renovação vivo de populações de células purificadas, preferencialmente durante passagens em série, deve ser avaliada a fim de provar ou refutar a função das células-tronco. Neste contexto, a capacidade de propagar prospectivamente e, simultaneamente, várias populações de células estaminais e progenitoras é um aspecto crucial do ensaio de formação de esfera e torna este ensaio altamente valiosa para o campo CSC; contanto que as suas limitações são mantidos em mente para a interpretação dos dados obtidos.
Os ensaios de formação de esfera têm sido amplamente utilizados para identificar células estaminais retrospectivamente com base na sua capacidade de auto-renovação e diferenciação ao nível da célula individual in vitro. A descoberta de marcadores que permitem o isolamento de células estaminais em perspectiva e a sua progénie de seu nicho in vivo permite que as propriedades funcionais de populações purificadas a ser definida. O combination de ensaio de formação de esfera e o FACS é uma estratégia eficaz para isolar as células de tecido sólido ou enriquecer subpopulações específicas de PDAC em cultura. Por exemplo, a expressão simultânea de EpCAM, CD24 e CD44 define uma subpopulação de CSCs capaz de: auto-renovação, diferenciar e iniciar um tumor, o que reflecte a heterogeneidade do tumor original. Hermann et ai. mostrou que as células CD133 + possuía capacidade proliferativa aumentada e CSC dispõe de 15. Outros marcadores também têm sido utilizados para a caracterização das CSCs: expressão (1-desidrogenase aldeído) ALDH- 1 está associada com células altamente tumorigénicas em 38 cancro do pâncreas; células capazes de excluir o corante de ADN Hoechst 33342, população lado nomeado (SP) células, têm a capacidade comprovada para iniciar tumores 39. Recentemente, nós mostramos que um compartimento subcelular autofluorescência caracteriza uma população distinta de células humanas com traços exclusivos CSC em diferentes tipos de tumores40. Apesar de nenhum destes marcadores parece caracterizar selectivamente uma população pura das CSCs, combinações de marcadores mais complexos e mais precisa de ser utilizado para purificar FACS populações de células mais refinados.
Muitas questões ainda permanecem sobre o papel preciso de CSCs na origem, progressão, e resistência a drogas de tumores. Por exemplo, uma maneira de abordar a questão de evolução clonal para definir se e como um único CSC inicia um tumor, poderia ser a de analisar amostras de pacientes em diferentes estágios da doença, e especificamente seguir os números de CSCs durante e após o tratamento. Ao responder a estas perguntas, podemos fazer progressos significativos do nosso conhecimento de CSCs em tumores sólidos e desenvolver terapias medicamentosas para prevenir a progressão do tumor e, em última análise recaída.
The authors have nothing to disclose.
A presente pesquisa foi apoiada por uma ERC avançada Investigator Grant (Pa-CSC 233460), Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7 / 2007-2013) ao abrigo do contrato de concessão nº 256974 (EPC-TM-NET) e Sem 602,783 (CAM-PAC ), o Subdirección Geral de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 & PI12 / 02.643), eo Programa Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, Espanha). E. Lonardo foi apoiado pela Roche Fellowship. M. Cioffi foi apoiado pelo Programa de Bolsas Predoctoral La Caixa.
Counting Chamber/Hemocytometer | Hausser Scientific Co | 3200 | |
CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement | Roche Innovatis | AG CASY Model TTC 45,60,150 μm | |
GentleMACS Dissociator | Miltenyi Co | 130-093-235 | |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Co | 130-093-237 | |
24-well Ultra-low Attachment Plates | Corning | 3474 | |
100-mm tissue culture dishes | BD Falcon | 353803 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
15-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
50-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
1.5 ml sterile tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
50 ml centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
Sterile petri dishes, 10 cm dishes | Corning | 353003 | |
26G needles | BD Falcon | 300600 | |
100 ul Hamilton Syringe | Hamilton Syringe Co | 81075 | |
Collagenase type IV | Stem Cell Technologies | 7909 | |
RPMI Medium 1640 | Life technologies | 11875-085 | |
Penicillin/Streptomycin solution, 100X | Life technologies | SV30010 | |
Metformin | Sigma | D150959-5G | |
L-glutamine, 200 mM, 100X | Life technologies | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
100mM Sodium Pyruvate solution | Life technologies | 11360-070 | |
Seahorse Assay medium | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive | BD Biosciences | 354240 | |
Trypsin solution, 0.05% | Life technologies | 25300054 | |
B27 Supplement 50x | Life technologies | 17504-044 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | Sigma | F0291 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9576 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12 | Sigma | D8437 | |
Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Trypan Blue | Life technologies | 15250-061 | |
Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate) | Life technologies | C-369 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Ethanol 70% (vol/vol) | Sigma | 459844 | |
Isofluorane | IsoVet, Braun | 571105.8 | |
Matrigel | BD Biosciences | 35620 | |
Sterile Cotton tipped applicator | Puritan medical | ||
XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
XF96e Extracellular Flux analyzer | Seahorse Bioscience | ||
Incubator with CO2 input | |||
Micro scissors | |||
Curved forceps | |||
Splinter forceps | |||
Caliper |