Indkapsling Thermogenic præadipocytter for transplantation i fedtvæv Depoter

Summary

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Abstract

Celleindkapsling blev udviklet for at indfange levedygtige celler i semi-permeable membraner. De indpodede indkapslede celler kan udveksle lavmolekylære metabolitter i væv af den behandlede vært at opnå langsigtet overlevelse. Den semipermeable membran tillader podet indkapslede celler for at undgå afstødning af immunsystemet. Indkapsling proceduren blev designet til at give en kontrolleret frigivelse af bioaktive forbindelser, såsom insulin, andre hormoner og cytokiner. Her beskriver vi en fremgangsmåde til indkapsling af kataboliske celler, der forbruger lipider til varmeproduktion og energispredning (thermogenesis) i det intra-abdominale fedtvæv af fede mus. Indkapsling af termogeniske kataboliske celler kan være potentielt anvendelig til forebyggelse og behandling af fedme og type 2-diabetes. En anden potentiel anvendelse af kataboliske celler kan omfatte afgiftning fra alkoholer eller andre giftige metabolitter og miljøforurening.

Introduction

Stigende forekomst af kroniske sygdomme ¹ har stimuleret undersøgelser af transplantation af terapeutiske cellepopulationer ^2. Syngeniske eller allogene stamceller er de mest almindeligt anvendte typer celle til disse applikationer ^2. Men disse behandlinger ikke tillader styring af differentiering og migration af stamceller efter implantation og er ikke omkostningseffektiv. Transplantation af genetisk modificerede celler med fordelagtige funktioner forventer forbedre behandlingen af ​​mange sygdomme. Imidlertid er de genetiske modifikationer celle genkendes af værtens immunsystem, og derfor kan disse behandlinger kræver immunosuppression ^3. Indkapsling af celler, der producerer insulin er blevet udviklet af Dr. Chang ^4. Teknikken er baseret på indkapsling af celler i alginat dråber, der er nedsænket i en calciumchloridopløsning. Alginatmolekyler består af mannuron- (M) og guluronsyre (G) og kan forbindes ved Ca2 ⁺. Efter gelering perlerne suspenderet en poly-L-lysin (PLL) opløsning. Under dette trin, PLL binder til G og M i alginat molekyler, som fastlægger kapslen membran. Porøsiteten af ​​kapslen membran kan moduleres ved at variere M og PLL koncentrationer, inkubationstiden og temperatur. Bindingen af ​​PLL afhænger også af typen og koncentrationen af ​​alginat. Alginat matricer tværbundet med Ca2 ⁺ -ioner, er ustabile i det fysiologiske miljø eller i offentlige pufferopløsninger med høj koncentration af phosphat og citrationer. Disse buffere kan udtrække Ca ²⁺ fra alginat og flydende kernen. Flydendegørelse af alginat-kerne giver plads inde i kapsler til cellulær bevægelse og vækst. Celler indkapslet i polyanionisk alginat med polykationisk poly-L-lysin (APL) er uigennemtrængelige for immunoglobuliner, men har tilstrømning af næringsstoffer og udstrømning af toksiner. Disse APL egenskaber gør det muligt på sigt survival af indkapslede celler efter transplantation ind i genetisk forskellige værter. Elliott et al. Rapporterede overlevelsen af fungerende indkapslede porcine pancreasceller i en human patient ni år efter implantation ^5.

Indkapslingsteknikker kan klassificeres i mikroindkapsling (3-800 um) og makroindkapsling (større end 1.000 um). Mikrokapsler er mere holdbare end makrokapsler ^6. Siden opdagelsen af Dr. Chang og kolleger i 1964 har mikroindkapsling været meget anvendt til indkapsling af anabolske celler, der producerer insulin, andre hormoner og bioaktive molekyler ^7. Disse behandlinger står flere udfordringer i værtsvævet herunder fibrose og immunrespons ^8. I første omgang har bivirkninger relateret til kvaliteten af ​​biopolymerer blevet løst. Men transplantation af anabolske celler stadig initierer bivirkninger, såsom fibrose, som et resultat af hormon overproduktion uden for en specialiseret kirtel.

I de seneste årtier, fedme og type 2-diabetes har nået epidemiske proportioner ^9. Mere end 30% af voksne mennesker verden over er overvægtige og fede ^10. Øget intraabdominalt (IAB) fedt dannelse øger forekomsten af kronisk inflammation og fremmer type 2-diabetes, hjerte-karsygdomme, visse kræftformer og andre følgesygdomme ^11-13. Adskillige linjer af beviser foreslået, at patogenese forbundet med IAB fedt kan afværges ved bestemte adipocytter. Nylige undersøgelser har vist, at transplantation af subkutane adipocytter i lab region kan forbedre metabolismen og reducere fedme og insulinresistens hos gnavere in vivo ^14. Effektiv reduktion af fedme og insulinresistens er blevet forbundet med termogene adipocytter der kan sprede energi i form af varme ^15,16. Termogene modifikation af adipocyter kan opnås ved stabil transfektionaf gener, der deltager i mitokondrie proton afkobling, såsom frakobling protein 1 (UCP1) eller gener, der regulerer ekspression af UCP1 og andre termogene gener ^15,16. Vore nylige undersøgelser viste, at utilstrækkelig aldehyddehydrogenase 1 a1 (Aldh1a1) fører til den termogene remodeling af lab fedt, der reducerer fedme og insulinresistens hos disse mus ^17,18. Især indkapsling af termogene Aldh1a1 deficient (Aldh1a1 – / -) præadipocytter medierer samme terapeutiske virkning i IAB fedt i fede vildtypemus, hvilket tyder på nye terapeutiske muligheder for behandling af lab fedt ^18. I eksperimentelle indstillinger, indkapslede celler give forskerne mulighed for at studere virkningerne af specifikke cellepopulationer i en omkostningseffektiv måde ^19. Her vi diskutere metoden til indkapsling af en termogen katabolisk cellelinie og dets laboratorium og terapeutisk anvendelse i en musemodel af fedme. Protokollen beskriver tEfter tre faser for mikrokapsel produktion (figur 1): dannelsen af alginat mikroperler (figur 1A), dannelsen af det polykationiske poly-L-lysin (PLL) membraner på overfladen af mikroperler (figur 1B), og fjernelse af alginat kerner (figur 1C).

Protocol

Undersøgelsen protokol blev godkendt af Ohio State University etiske komitéer. Dyreforsøg blev godkendt af IACUC protokol. Alle procedurer blev udført under niveau 2 biosikkerhed kabinet med laminar strømning. Vi fulgte alle standard sikkerhedskrav og procedurer. Mikroindkapslingen teknik til fremstilling af mikrokapsler er blevet udført som beskrevet 17, 18. 1. Forberedelser af materialer Forbered 10 ml 2% natriumalginatopløsning i autoklaveret fysiologisk saltv…

Representative Results

Figur 1 viser, at alle trin af mikroperler produktion kunne kontrolleres under mikroskopet. Figur 2A viser, hvordan man co-kultur adipocytter med et monolag af indkapslede celler. Figur 2B er et repræsentativt eksempel på en kvantitativ undersøgelse under anvendelse adipocytspecifikke / mikrokapsler co-kulturer, der blev beskrevet i afsnit 5. Lysater af adipocytter blev analyseret ved hjælp af Western blot. Indkapslede celler blev ikke analyseret i dette eksperiment…

Discussion

Forskellige fremgangsmåder er blevet anvendt til indkapsling af celler, herunder tørring, ekstrudering og emulsion ^19. Ved denne fremgangsmåde er alginatkuglerne ekstruderet gennem en nål, derefter coatet med PLL og alginat kerne vil blive opløst for at fuldføre indkapsling. Selv om denne metode har været brugt i årevis, dannelse af perlerne med den ønskede størrelse og kugleform er stadig udfordrende. Størrelsen af kapslerne er meget afhængig af viskositeten af natriumalginatopløsning, ekstruder…

Materials

Encapsulation device (VAR V1)	Nisco	LIN-0042	None
KD scientific syringe pump	KD scientific	780100Y	None
Olympus microscope	Olympus Optical	IX70-S8F2	None
Sodium alginate	Sigma	MKBP8122V	None
Poly-l-lysine hydrobromide (PLL)	Sigma	020M5006V	None
Calcium chloride	Sigma	SLBJ2662V	None
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma	030M0200	None
Sodium chloride	Sigma	SLBD2595V	None
Mini-PROTEAN TGX Gels	Bio-Rad	456-1093	None
ATGL primary antibody (from rabbit)	Cell Signaling	2138S	None
Secondary anti body (anti rabbit)	LI-COR	926-68071	None
Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer	Boston BioProducts	D25Y6Z	None
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	RNBD2893	None
Trypsin	Gibco	25200-056	None
Cortizone 10 anti-itch ointment	Cortizone 10	C4029138	None
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-092	None
Newborn calf serum (CS)	Sigma	N4762	None
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F4135	None
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma	I0516	None
Dexamethasone	Sigma	D4902	None
Insulin (bovine)	Sigma	I5879	None
Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	4693159001	None