Automatiseret Cell Berigelse af cytomegalovirus-specifikke T-celler til kliniske applikationer ved hjælp af Cytokin-capture system
Summary
The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.
Abstract
Adoptiv overførsel af patogen-specifikke T-celler kan anvendes til forebyggelse og behandling af opportunistiske infektioner såsom cytomegalovirus (CMV) -infektion forekommer efter allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation. Viral-specifikke T-celler fra allogene donorer, herunder tredjeparts donorer, kan formeres ex vivo i overensstemmelse med gældende god fremstillingspraksis (cGMP), som beskæftiger gentagne runder af antigen-drevet stimulering til selektivt udbrede ønskede T-celler. Identificering og isolering af antigenspecifikke T-celler kan også foretages på basis af cytokin datafangstsystem af T-celler, der er blevet aktiveret til at udskille gamma-interferon (IFN-γ). Imidlertid har udbredt anvendelse på mennesker af cytokin capture-system (CCS) for at hjælpe med at genoprette immunitet været begrænset, da produktionsprocessen er tidskrævende og kræver en dygtig operatør. Udviklingen af en anden generation celle berigelse enhed såsom CliniMACS Prodigy nugiver forskere at generere viral-specifikke T-celler under anvendelse af en automatiseret, mindre arbejdskrævende system. Denne enhed separerer magnetisk mærkede celler fra umærkede celler ved hjælp af magnetisk cellesortering teknologi til at generere klinisk-grade produkter, er manipuleret som et lukket system, og kan tilgås og drives på benchtop. Vi demonstrerer, hvorledes denne nye automatiserede celle berigelse enhed til at fremstille CMV pp65-specifikke T-celler opnået fra en steady-state aferese produkt opnået fra en CMV-seropositive donor. Disse isolerede T-celler kan derefter direkte infunderes i en patient under institutionelt og føderale tilsyn. Alle bio-bearbejdningstrin herunder fjernelse af røde blodlegemer, er stimulering af T-celler, adskillelse af antigen-specifikke T-celler, rensning og vask fuldautomatisk. Enheder såsom dette hæve den mulighed, at T-celler til human anvendelse kan fremstilles uden for dedikerede god fremstillingspraksis (GMP) Faciliteter og i stedet blive produceret i blodet bankfaciliteter hvor personalet kan tilsyn automatiserede protokoller til at producere flere produkter.
Introduction
Hæmatopoietisk stamcelle transplantation (HSCT) 1 kan kombineres med adoptiv T-celleterapi at forbedre graft-versus-tumor effekt og give immunitet over for opportunistiske infektioner 2. Generering af antigen-specifikke donor-afledte T-celler til infusion har historisk krævet faglært personale og anvendelse af specialiserede faciliteter, der er GMP-kompatibel. Levering af sådanne T-celler har resulteret i løsningen af opportunistiske infektioner 3 samt behandle den underliggende malignitet 4. For nylig har forskere vist, at adoptiv overførsel af kun få tusinde virus-specifikke T-celler (~ 1 x 10 4 – 2,5 x 10 5 celler / kg af modtagerens legemsvægt) kan med held behandle opportunistiske infektioner efter CMV allogen HSCT 5-9. Et begrænset antal GMP faciliteter med tilhørende dygtige produktionskrav og de høje omkostninger forbundet med celle produktion har imidlertid restricted patient adgang til lovende T-celleterapi 10. En metode til isolering af antigenspecifikke T-celler er baseret på CCS ved hjælp af en bi-specifikt reagens til at genkende CD45 og IFN-γ. Som det er vist, kan denne metode anvendes til at frembringe klinisk kvalitet CMV-specifikke T-celler under anvendelse af en automatiseret celle berigelse CCS enhed (figur 1B).
CMV-specifikke T-celler genereres ved at inkubere overlappende peptider fra CMV pp65-antigen med leukaferese samlede nukleare celler (TNC) fra CMV-seropositive donorer. Disse peptider, der vises i forbindelse med human leukocyt antigen (HLA), aktivere CMV pp65-specifikke T-celler i TNC at udskille IFN-γ. Disse T-celler kan derefter "fanget", og magnetisk adskilt. Driften af den første generation af celle berigelse enhed (figur 1A), der kræves personale faglærte i cellekultur under GMP betingelser, og koordinering af personale til at foretage de mange sbeskæftigelsespagterne nødvendigt at generere en "fanget" produkt.
Proceduren typisk kræves 10 til 12 timers kontinuerlig drift, og derfor personale sandsynligvis nødt til at arbejde over to skift i GMP facilitet. Disse begrænsninger er nu undgås ved gennemførelsen af en anordning, andengenerations (vist i figur 1B). Denne enhed forpligter magnetiske berigelse, svarende til den første generation enhed, men automatiserer andre aspekter af CCS i en unbreached tilgang. Dette reducerer belastningen af GMP teamet, da de fleste af de skridt kan udføres uden opsyn af personale. Eftersom enheden fungerer som et lukket system, det antigen-specifikke T-celler kan indfanges og behandles i laboratoriet med undtagelse af trin involveret i leukaferese isolation og fremstilling af materialer før start instrumentet. Detaljer for den komplette instrumentering og funktionalitet af denne anden generation celleberigelse enhed blevet pubnedsat 11.
Her beskriver vi de trin, som vil berige CMV pp65-specifikke T-celler fra en steady-state afereseprodukt hjælp af automatiserede celle berigelse CCS system. Efter isolering kan disse CMV-specifikke T-celler straks infunderes i en patient.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adoptiv T-celle terapi har vist sig som en farbar vej til at behandle B-celle cancerformer 4. Dets terapeutiske potentiale er afhængig infusion det ønskede antal target antigenspecifikke T-celler, der mangler replikativ senescens 2. Dette kan opnås ved at sortere en ren population af antigenspecifikke T-celler fra ekspanderede T-celler i overensstemmelse med gældende god fremstillingspraksis. To sortering procedurer er meget udbredt, nemlig fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) og magneti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.
Materials
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 mL Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/mL) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst’s Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
- Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
- Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), 55-59 (2014).
- Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
- Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
- Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
- Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
- Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
- Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
- Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
- Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
- Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
- Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).
