Sitokin yakalama Sistemi kullanılarak Klinik Uygulamalar için Sitomegalovirüs özgü otomatik Hücre Zenginleştirme T hücreleri
Summary
The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.
Abstract
Patogene-özgü T hücrelerinin adoptif transfer önlenmesi ve allogeneik kök hücre transplantasyonundan sonra ortaya çıkan gibi enfeksiyon (CMV), sitomegalovirüs gibi fırsatçı enfeksiyonları tedavi etmek için de kullanılabilir. Üçüncü şahıs bağışçı olmak üzere allojenik vericilerden, viral-spesifik T hücreleri, seçici istenen T hücrelerini yaymak için antijen-odaklı uyarım tekrarlanan mermi kullanan mevcut iyi üretim uygulamaları (cGMP) uygun olarak ex vivo olarak yayılan olabilir. Antijen-spesifik T hücrelerinin tanımlanması ve izolasyonu da gama-interferon (IFN-γ) salgılamaya aktive edilmiş T hücrelerinin sitokin yakalama sistemine dayalı yapılabilir. Üretim süreci zaman alıcı ve yetenekli bir operatör gerektirir Ancak, bağışıklık geri yardımcı olmak için sitokin yakalama sistemi (CCS) yaygın insan uygulaması sınırlı kalmıştır. Şimdi bu CliniMACS Prodigy gibi ikinci nesil hücresi zenginleştirme cihazının geliştirilmesiotomatik bir, daha az emek yoğun bir sistem kullanılarak viral özgü T hücrelerinin üretilmesi için araştırmacılar sağlar. Bu cihaz, manyetik klinik sınıf ürünler üretmek için bir manyetik etkinleştirilmiş hücre tasnif teknolojisi kullanılarak etiketlenmemiş hücrelerden hücreler etiketli ayırır, kapalı bir sistem olarak tasarlanmıştır ve masa üstü erişilebilen ve çalıştırılabilir. Bu yeni otomatik hücresi zenginleştirme Cihazın çalışması, bir CMV seropozitif vericiden elde edilen bir kalıcı-hal aferez ürününden elde edilen CMV pp65-spesifik T hücreleri üretmek için göstermektedir. Bu izole edilmiş T hücreleri, daha sonra doğrudan, kurumsal ve federal düzenleme denetimi altında bir hastaya infüze edilebilir. Kırmızı kan hücrelerinin ortadan kaldırılması dahil olmak üzere tüm biyo-işlem aşamaları, T hücreleri, antijen-spesifik T hücrelerin, saflaştırma ve yıkama ayrılmasının uyarılması tam olarak otomatikleştirilmiştir. Bu gibi cihazlar, insan uygulaması için T hücreleri GMP (özel iyi üretim uygulamaları dışında imal edilebilmesi olasılığı ortaya) Yerine tesisleri ve personel birden ürünler üretmek için otomatik protokolleri denetleyebilir kan bankacılığı tesislerinde üretilecek.
Introduction
Hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) 1, graft-versus-tümör etkisini arttırmak ve fırsatçı enfeksiyonlara 2 bağışıklığı sağlamak için adoptif T-hücre terapisi ile kombine edilebilir. Infüzyon için antijene spesifik donör kaynaklı T hücrelerinin üretilmesi tarihsel kalifiye personel ve GMP uyumlu olan uzman tesislerin kullanılmasını gerektirmiştir. Bu T hücrelerinin dağıtım fırsatçı enfeksiyon 3 çözünürlüğü hem de altta uzanan malignite 4 tedavi ile sonuçlanmıştır. Yakın geçmişte, araştırmacılar göstermiştir ki bin az sayıda virüs spesifik T hücrelerinin adoptif transfer (~ 1 x 10 4-2,5 x 10 5 hücre / kg alıcı vücut ağırlığı) başarılı bir şekilde HKHN 5-9 sonra fırsatçı CMV enfeksiyonları tedavi olabilir. Ilişkili vasıflı imalat şartlarına GMP tesislerinin sınırlı sayıda ve hücre üretimi ile ilişkili yüksek maliyetli, ancak, restr vardırT-hücre tedavileri 10 vaat için icted hasta erişim. Antijen-spesifik T hücrelerinin izole edilmesi için bir yaklaşım, CD45 ve IFN-y tanımak için bir çift spesifik bir reaktif kullanılarak CCS dayanmaktadır. Gösterildiği gibi, bu yöntem, bir otomatik hücre ilave CCS cihazı (Şekil 1B) kullanılarak klinik düzeyde CMV-spesifik T hücreleri üretmek için kullanılabilir.
CMV-spesifik T hücreleri, CMV-seropozitif donörlerden lökaferez, toplam nükleer hücreler (TNC) CMV pp65 antijeninden örtüşen peptidlerin inkübe edilerek oluşturulur. İnsan lökosit antijen (HLA) bağlamında gösterildi Bu peptidler, IFN-y salgılaması için TNC olan CMV pp65-spesifik T hücrelerini aktive etmektedir. Bu T hücreleri daha sonra "esir" olmak ve manyetik ayrılmış olabilir. Birinci nesil cep zenginleştirme cihazının çalışması (Şekil 1A) birden s üstlenmek GMP koşulları altında hücre kültüründe yetişmiş personel gerekli ve personelin koordinasyonuBir "esir" ürünü üretmek için gerekli Teps.
Prosedür genellikle sürekli çalışma 12 saat için 10 gerekli ve bu nedenle personelin büyük olasılıkla GMP tesisi iki vardiya üzerinden çalışmak gerekiyor. Bu kısıtlamalar, artık (Şekil 1B de gösterilen), bir ikinci kuşak cihazının uygulanması ile ortadan kaldırılır. Bu cihaz, ilk nesil cihaza benzer manyetik zenginleştirme, taahhüt, ancak bir unbreached bir yaklaşımla CCS'nin diğer yönlerini otomatik hale getirir. Bu önemli ölçüde adımların en personeli tarafından sahipsiz yapılabilir olarak GMP ekibi üzerindeki yükü azaltır. Cihaz, bir kapalı bir sistem olarak işlev Dahası, antijen-spesifik T hücrelerinin yakalanır ve cihazı başlamadan önce lökaferez izolasyonu ve materyallerin hazırlanmasında yer alan adımları dışında masa üstü işlenebilir. Tam enstrümantasyon ve bu ikinci nesil cep zenginleştirme cihazın işlevselliği Detayları pub edilmiştir11 yayımlanır.
Burada, biz otomatik hücre zenginleştirme CCS sistemini kullanarak bir kararlı durum aferez üründen CMV pp65-spesifik T hücrelerini zenginleştirmek için gereken adımları açıklar. Bir kez izole edildiğinde, bu, CMV-spesifik T hücreleri, hemen bir hastaya infüzyon yoluyla olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Evlatlık T-hücre tedavisi B-hücresi maligniteler 4 tedavisinde uygulanabilir bir seçenek olarak ortaya çıkmıştır. Bu tedavi edici potansiyeli replikatif yaşlanmayla 2 barındırmayan hedef antijene özel T hücreleri istenen sayıda beslerken bağlıdır. Bu halen geçerli gıda işleme uygulamalarıyla uyumlu genişletilmiş T hücrelerinden antijen belirli T hücrelerinin saf bir nüfus ayrıştırılması ile elde edilebilir. İki ayırma işlemleri yaygın olarak, yani, floresans ile …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.
Materials
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 mL Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/mL) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst’s Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
- Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
- Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), 55-59 (2014).
- Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
- Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
- Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
- Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
- Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
- Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
- Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
- Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
- Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
- Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).
