Neural Differentiering af Mouse Embryonale stamceller i Serumfrit monolagskultur
Summary
This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.
Abstract
Evnen til at differentiere muse embryonale stamceller (ESC) til neurale progenitorer muliggør studiet af de mekanismer, der styrer neurale specifikation samt generering af modne neurale celletyper til yderligere undersøgelse. I denne protokol beskriver vi en fremgangsmåde til differentiering af ESC til neurale progenitorer anvendelse af serum-frit, monolagskultur. Fremgangsmåden er skalerbar, effektiv og resulterer i produktion af ~ 70% neurale progenitorceller inden 4 – 6 dage. Det kan anvendes til ESC fra forskellige stammer, der dyrkes under forskellige betingelser. Neurale progenitorer kan tillades at differentiere yderligere i funktionelle neuroner og glia eller analyseres ved mikroskopi, flowcytometri eller molekylære teknikker. Differentieringsprocessen kan underkastes time-lapse mikroskopi og kan kombineres med anvendelsen af reporter linjer til at overvåge neurale specifikation processen. Vi giver detaljerede instruktioner om forberedelse medier og celletæthed optimering at lade processen til be anvendt på de fleste ESC linjer og en række celle dyrkningsbeholdere.
Introduction
Embryonale stamceller er pluripotente celler afledt fra den tidlige embryon med kapacitet til at proliferere på ubestemt tid in vitro, mens evnen til at differentiere til alle voksne celletyper efter genindførsel i et passende trin embryo (ved at danne en kimære), injektion i syngene eller immunkompromitterede værter (ved at danne en teratom) eller in vitro underlagt passende tidskoder 1. In vitro differentiering af muse embryonale stamceller i neurale afstamninger blev først beskrevet i 1995 og involverede dannelsen af flercellede suspension aggregater (embryoide legemer, EB) i serum-holdige medier suppleret med morfogenet retinsyre 2-4. Siden da en række protokoller er blevet udviklet for at muliggøre neural differentiering 5. Mange stadig udnytter sammenlægning, andre co-kultur med at fremkalde celletyper og flere indebære brug af serum-frie medier. Alle protokoller har fordele ennd ulemper og den nøjagtige karakter af neurale eller neuronale celler produceres også varierer alt efter den anvendte protokol.
Den ideelle protokol ville være robust, skalerbar og gøre brug af fuldt definerede medier og substrater kunne godtage ikke-invasiv overvågning af differentiering processen og resultere i dannelsen af rene populationer af neurale stamceller i stand til at være mønstret af eksterne signaler og til at differentiere i alle neuronale og gliale undertyper med høj effektivitet og udbytte på relativt kort tid. I de sidste snes år har vi brugt en metode til generering neurale stamceller og neuroner fra mus ESC i en lav tæthed, serumfrit vedhængende monolagskultur 6-10. Denne protokol opfylder mange af de kriterier, der er anført ovenfor: i vores hænder effektiviteten af differentiering har været ret konsekvent over mange år, og en række forskellige cellelinjer, kan det skaleres op eller ned (vi med succes anvender skibe fra 96-brønds plader til 15 cm i diameter dishes) og de anvendte medier er veldefineret. Processen kan underkastes timelapse mikroskopi for overvågning af differentieringen og en række mønsterdannende stikord kan tilsættes for at inducere dannelsen af forskellige former for neuronale undertyper (f.eks Shh og FGF8 for dopaminerge neuroner 6).
Ikke desto mindre er der nogle udfordringer for vellykket anvendelse af denne protokol. Et af de centrale aspekter er omhyggelig forberedelse af medierne. Vi forbereder altid medierne internt trods af tilgængeligheden af kommercielle alternativer. En af de kosttilskud, der anvendes (N2, se protokollen) har ændringer over standard kommercielt tilgængelige versioner. Endelig er et af de vigtigste skridt for en vellykket anvendelse af denne metode er den optimale celledensitet på plating. Dette er hovedsageligt fordi mens autokrine karakter af en af de inducerende signaler (FGF4 11) kræver, at der er tilstrækkelige celler er til stede for at give optimal viability og differentiering, ved for høje tætheder differentiering er svækket (eventuelt delvis skyldes autokrine produktion af LIF 12). Derfor er det vigtigt, at forberedelsen begge medier og celle plating udføres omhyggeligt og konsekvent for at sikre optimale resultater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den monolag neural differentiering protokol har været i brug i over et årti 6. Protokollen er meget effektiv, sammensat af defineret medium, og udført i et monolag, som gør systemet mere anvendeligt til præklinisk (f.eks lægemiddelscreening) anvendelser. Der er dog nogle kritiske faktorer, der bestemmer differentiering effektivitet. Denne artikel påpeger disse faktorer og løsningen for hver forhindring.
Densitet af cellerne efter udpladning i differentieringen til…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti betaIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-Mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 | |
References
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).
