सीरम मुक्त Monolayer संस्कृति में माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं के तंत्रिका भेदभाव
Summary
This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.
Abstract
तंत्रिका progenitors करने के लिए माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता (ईएससी) तंत्रिका विशिष्टता के रूप में अच्छी तरह से आगे के अध्ययन के लिए परिपक्व तंत्रिका कोशिका प्रकार की पीढ़ी को नियंत्रित तंत्र के अध्ययन की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में हम सीरम मुक्त, monolayer की संस्कृति का उपयोग कर तंत्रिका progenitors के लिए ईएससी के भेदभाव के लिए एक विधि का वर्णन। विधि कुशल, स्केलेबल है और 4 के भीतर 70% तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं ~ के उत्पादन में परिणाम – 6 दिन। यह स्थितियों की एक किस्म के अधीन हो विभिन्न प्रकारों से ईएससी के लिए लागू किया जा सकता है। तंत्रिका progenitors, माइक्रोस्कोपी द्वारा कार्यात्मक न्यूरॉन्स और glia या विश्लेषण किया में आगे अंतर cytometry या आणविक तकनीक का प्रवाह करने की अनुमति दी जा सकती है। भेदभाव प्रक्रिया समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए उत्तरदायी है और तंत्रिका विनिर्देश प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए संवाददाता लाइनों के उपयोग के साथ जोड़ा जा सकता है। हम प्रक्रिया ख के लिए अनुमति देने के लिए मीडिया की तैयारी और सेल घनत्व अनुकूलन के बारे में विस्तृत निर्देश प्रदानई सबसे ईएससी लाइनों और सेल संस्कृति वाहिकाओं की एक किस्म के लिए आवेदन किया।
Introduction
भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं syngeneic या प्रतिरक्षा अक्षमता मेजबानों में (एक chimaera के गठन से) के लिए एक उपयुक्त मंच भ्रूण में reintroduction के बाद सभी वयस्क प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता, इंजेक्शन बनाए रखते हुए इन विट्रो में अनिश्चित काल के लिए पैदा करने की क्षमता के साथ जल्दी भ्रूण से ली गई pluripotent कोशिकाओं रहे हैं (एक teratoma के गठन से) या उचित संकेतों 1 करने के लिए इन विट्रो विषय में। तंत्रिका प्रजातियों में माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं की इन विट्रो भेदभाव पहले 1995 में वर्णित है और morphogen retinoic एसिड 2-4 के साथ पूरक सीरम युक्त मीडिया में बहुकोशिकीय निलंबन समुच्चय के गठन (embryoid निकायों, ईबीएस) शामिल किया गया था। तब से प्रोटोकॉल की एक किस्म तंत्रिका भेदभाव 5 अनुमति देने के लिए विकसित किया गया है। अभी भी एकत्रीकरण का उपयोग कई लोग दूसरों प्रकार की कोशिकाओं उत्प्रेरण के साथ-संस्कृति सीओ और कई सीरम मुक्त मीडिया के इस्तेमाल को शामिल। सभी प्रोटोकॉल फायदे एक हैएन डी नुकसान और तंत्रिका की सटीक प्रकृति या neuronal कोशिकाओं का भी इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के अनुसार बदलता रहता है का उत्पादन किया।
आदर्श प्रोटोकॉल, मजबूत स्केलेबल हो सकता है और पूरी तरह से परिभाषित मीडिया और substrates का इस्तेमाल करते हैं, भेदभाव प्रक्रिया के गैर इनवेसिव निगरानी करने के लिए उत्तरदायी हो सकता है और सक्षम तंत्रिका progenitors के शुद्ध आबादी की पीढ़ी में परिणाम बाहरी संकेतों से और अलग करने के लिए नमूनों के लिए होगा एक अपेक्षाकृत कम समय में उच्च दक्षता और उपज के साथ सभी neuronal और glial उपप्रकारों में। पिछले दर्जन वर्षों में हम एक कम घनत्व, सीरम मुक्त पक्षपाती monolayer की संस्कृति 6-10 में माउस ईएससी से तंत्रिका progenitors और न्यूरॉन्स पैदा करने के लिए एक विधि का उपयोग किया गया है। इस प्रोटोकॉल के ऊपर निर्धारित मापदंड के कई को पूरा: हमारे हाथ में भेदभाव की क्षमता काफी कई वर्षों से लगातार और सेल लाइनों की एक किस्म के लिए किया गया है, इसे नीचे तक पहुंचा जा सकता है या (हम सफलतापूर्वक करने के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेटों से जहाजों का उपयोग 15 सेमी व्यास डिshes) और इस्तेमाल किया मीडिया अच्छी तरह से परिभाषित कर रहे हैं। प्रक्रिया (डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स 6 के लिए उदाहरण के लिए, श्श्श और Fgf8) न्यूरोनल उपप्रकार के विशिष्ट प्रकार की पीढ़ी को प्रेरित करने के लिए जोड़ा जा सकता है भेदभाव की निगरानी और patterning के संकेतों की एक किस्म के लिए timelapse माइक्रोस्कोपी के लिए उत्तरदायी है।
फिर भी, इस प्रोटोकॉल के सफल आवेदन करने के लिए कुछ चुनौतियों का सामना कर रहे हैं। महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक मीडिया से सावधान तैयारी है। हम हमेशा वाणिज्यिक विकल्प की उपलब्धता के बावजूद घर में मीडिया तैयार करते हैं। इस्तेमाल किया की खुराक में से एक (एन 2, प्रोटोकॉल देखें) मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संस्करणों में संशोधन किया है। अंत में, इस विधि के सफल आवेदन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक चढ़ाना पर इष्टतम सेल घनत्व है। उत्प्रेरण संकेतों में से एक (Fgf4 11) की autocrine प्रकृति की आवश्यकता है, जबकि इसका कारण यह पर्याप्त कोशिकाओं इष्टतम viabil अनुमति देने के लिए मौजूद हैं जो मुख्य रूप से हैबहुत अधिक घनत्व भेदभाव पर अल्पसंख्यक और भेदभाव, (कारण LIF 12 की autocrine उत्पादन करने के लिए संभवतः भाग में) बिगड़ा हुआ है। यह दोनों मीडिया तैयारी और सेल चढ़ाना ध्यान से प्रदर्शन कर रहे हैं और लगातार इष्टतम परिणाम सुनिश्चित करने के लिए कि इसलिए महत्वपूर्ण है।
Protocol
Representative Results
Discussion
monolayer के तंत्रिका भेदभाव प्रोटोकॉल एक दशक से अधिक 6 के लिए उपयोग में किया गया है। प्रोटोकॉल परिभाषित मध्यम से बना है, और preclinical के लिए प्रणाली को और अधिक लागू करता है जो एक monolayer प्रणाली में किया, अत्यधिक कु…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti betaIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-Mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 | |
References
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).
