Summary

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

Published: May 14, 2015
doi:

Summary

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Abstract

A capacidade de diferenciação de células estaminais embrionárias de ratinho (ESC) para progenitores neurais permite o estudo dos mecanismos que controlam especificação neural, bem como a geração de tipos de células neuronais maduros para estudo posterior. Neste protocolo, descrevem um método para a diferenciação de ESC para progenitores neurais utilizando, cultura em monocamada sem soro. O método é escalável, eficiente e resulta num rendimento de ~ 70% de células progenitoras neurais dentro de 4-6 dias. Ele pode ser aplicado a partir de várias estirpes CES cultivadas sob uma variedade de condições. Progenitores neurais podem ser autorizados a diferenciar ainda mais em neurônios funcionais e glia ou analisados ​​por microscopia, técnicas de citometria de fluxo ou moleculares. O processo de diferenciação é passível de microscopia de lapso de tempo e pode ser combinada com o uso de linhas de repórter para monitorizar o processo de especificação neural. Nós fornecemos instruções detalhadas sobre a preparação de meios e optimização densidade celular para permitir que o processo abe aplicado a maioria das linhas de ESC e uma variedade de recipientes de cultura de célula.

Introduction

As células estaminais embrionárias são células pluripotentes derivadas do embrião com a capacidade de proliferar indefinidamente in vitro, mantendo a capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células dos adultos após reintrodução num embrião fase adequada (através da formação de uma quimera), injecção em hospedeiros singénicos ou imunocomprometidos (através da formação de um teratoma) ou in vitro sujeitos a estímulos apropriados 1. A diferenciação in vitro de células estaminais embrionárias de ratinho em linhagens neurais foi descrita pela primeira vez em 1995 e envolveu a formação de agregados multicelulares suspensão (corpos embrióides, EBS) em meio contendo soro suplementado com o ácido retinóico morfogénio 2-4. Uma vez que, em seguida, uma variedade de protocolos têm sido desenvolvidos para permitir a diferenciação neuronal 5. Muitos ainda utilizar agregação, os outros co-cultura com indução de tipos de células e vários envolvem a utilização de meios isentos de soro. Todos os protocolos tem vantagens umand desvantagens e a natureza precisa da neural ou células neuronais produzida também varia de acordo com o protocolo utilizado.

O protocolo ideal seria robusta, escalável e fazer uso de meios totalmente definidos e substratos, ser passíveis de monitorização não invasiva do processo de diferenciação e resultar na geração de populações puras de células progenitoras neurais capazes de ser modelado por sinais externos e para diferenciar em todos os subtipos neuronais e gliais com elevada eficiência e rendimento em relativamente pouco tempo. Nos últimos doze anos, temos vindo a utilizar um método para gerar progenitores neurais e neurônios de rato ESC em uma baixa densidade, cultura monocamada aderente sem soro 6-10. Este protocolo cumpre muitos dos critérios enunciados anteriormente: em nossas mãos a eficiência de diferenciação tem sido bastante consistente ao longo de muitos anos e uma variedade de linhas de células, ele pode ser escalado para cima ou para baixo (que usamos com sucesso navios de placas de 96 poços para 15 cm de diâmetro diela é) e os meios usados ​​são bem definidos. O processo é passível de microscopia Timelapse para o controlo da diferenciação e uma variedade de padrões de sinais pode ser adicionado para induzir a geração de tipos distintos de subtipos neuronais (por exemplo, a Shh e Fgf8 para neurónios dopaminérgicos 6).

No entanto, existem alguns desafios para o sucesso da aplicação deste protocolo. Um dos aspectos fundamentais é uma preparação cuidadosa da mídia. Nós sempre preparar a mídia in-house, apesar da disponibilidade de alternativas comerciais. Um dos suplementos usados ​​(N2; ver Protocol) tem modificações sobre o padrão versões disponíveis no mercado. Finalmente, uma das etapas mais importantes para a aplicação bem sucedida deste método é a densidade celular óptima para o chapeamento. Isto é principalmente devido ao passo que a natureza autócrina de um dos sinais indutores (FGF4 11) requer que as células estão presentes suficientes para permitir viabil óptimadade e diferenciação, em muito altas densidades diferenciação é prejudicada (possivelmente em parte devido à produção autócrina de LIF 12). Portanto, é importante que a preparação ambos os meios e revestimento celular são realizadas com cuidado e de forma consistente para assegurar os melhores resultados.

Protocol

1. Preparação de mídia NOTA: O protocolo baseia-se na utilização de uma mistura de dois meios separados: DMEM / F12 suplementado com suplemento N2 modificado e Neurobasal suplementado com suplemento B27, tipicamente numa proporção de 1: 1. Prepara-se o suplemento N2 modificado por mistura dos componentes num tubo de 15 ml. Não vórtice ou filtrar este; misturar por inversão do tubo até a solução ficar clara. Iniciar pipetando 7,2 ml de DMEM / F12, em seguida a…

Representative Results

Nesta experiência, utilizou-se a linha de células de 14 46C, células estaminais embrionárias de ratinho com um endógeno Sox1-repórter GFP, para controlar a diferenciação neuronal. Utilizando esta linha celular, expressão de Sox1, um marcador para células progenitoras neurais, pode ser detectado por fluorescência verde. Chapeamento de densidade é um fator crítico para alcançar a diferenciação neuronal. Células estaminais embrionárias de ratinho foram plaqueadas em placas de 6 poços em difere…

Discussion

O protocolo de diferenciação neural monocamada tem sido usado por mais de uma década 6. O protocolo é altamente eficiente, composto de meio definido, e feito de um sistema de monocamada que torna o sistema mais aplicável para pré-clínica (por exemplo, o rastreio de fármacos) usa. No entanto, existem alguns factores críticos que determinam a eficiência de diferenciação. Este artigo aponta esses fatores ea solução para cada obstáculo.

Densidade das células a…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.

Materials

Fetal bovine serum Life Technologies 10270-106
DMEM/F12 Life Technologies 11320-074
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A11105-01
B-27 Supplement, serum free Life Technologies 17504-044
Insulin Sigma I6634 Reconstitute with sterile 0.01M HCl
Apo-transferrin Sigma T1147 Reconstitute with sterile water
Progesterone Sigma P8783 Reconstitute with ethanol
Putrescine Sigma P5780 Reconstitute with sterile water
Sodium selenite Sigma S5261 Reconstitute with sterile water
Bovine albumin fraction V Life Technologies 15260-037
L-Glutamine Life Technologies 25030-081 Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented
Gelatine Sigma G1890
6-well tissue culture dish Thermo Scientific 140675
24-well tissue culture dish Thermo Scientific 142475
96-well tissue culture dish Thermo Scientific 167008
GMEM Life Technologies 11710-035
Fetal bovine serum Life Technologies 10270-106
MEM Non-essential amino acids solution Life Technologies 11140-050
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-070
2-mercaptoethanol Sigma M7522
Leukaemia inhibitory factor prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods
Tween-20 Sigma P1379
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma D9542 Protect from light
Mouse anti betaIII tubulin IgG antibody Covance MMS-435P
Fluorescence-labelled anti-Mouse IgG antibody Life Technologies A31571 Protect from light
25cm2 tissue culture flask Thermo Scientific 156367

References

  1. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
  2. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
  3. Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
  4. Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
  5. Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
  6. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
  7. Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  8. Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
  9. Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
  10. Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
  11. Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
  12. Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
  13. Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
  14. Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).
  15. Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
  16. Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).
check_url/fr/52823?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture. J. Vis. Exp. (99), e52823, doi:10.3791/52823 (2015).

View Video