Tracking-Drug geïnduceerde veranderingen in Receptor Post-internalisatie mensenhandel door Colocalizational Analyse
Summary
Receptor handel moduleert signalering en celgevoeligheid liganden en zelf, reagerend op celomstandigheden, zoals ligand-geïnduceerde signalering. Hier beschrijven we een krachtige en flexibele techniek voor het kwantitatief beoordelen van geneesmiddel-geïnduceerde receptor handel met immunolabeling en colocalizational analyse.
Abstract
The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.
Introduction
Receptoren, met name G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs), routinematig intracellulair verhandeld, en naar het celoppervlak 1. Deze complexe, georkestreerd en strak gecontroleerde processen dicteren beschikbaar receptor complementen cellen 'en reguleren receptor tijdelijke activiteit, desensibilisatie, en resensitization 2-4. Belangrijk, deze processen reageren op cellulaire omgevingen zoals drugs geïnduceerde receptor activiteit of inactiviteit. Dat wil zeggen, kan de acties van liganden aan receptoren intracellulaire mensenhandel van die receptoren te veranderen, waardoor de cel responsiviteit veranderen. Op deze wijze extern liganden hebben nog meer effecten op celfunctie, zelfs buiten klassieke messenger-to-effector cascades 5,6.
Het onderzoeken van dergelijke wijzigingen in geïnduceerde receptor mensenhandel is moeilijk. Alle beschikbare technieken te betrekken beperkingen. Bescherming Biotine assays werden gebruikt Monitor oppervlak receptoren populaties. Deze receptoren worden gebiotinyleerd en een tijdsverloop van immunoprecipitaties uitgevoerd om de vermindering van gebiotinyleerde receptoren tijd kwantificeren. Deze techniek ziet wezen geleidelijke afbraak van een aanvankelijk, gelabeld populatie receptoren 7 en is zeer nuttig bij het construeren tijdsverloop van dit proces. Helaas is deze test kan niet anders dan de afbraak van de oorspronkelijke pool van receptoren, zoals internalisatie, recycling of nieuwe receptoren te monitoren. Ook kan de toevoeging van een antilichaam van de 150kDa bereik voor een receptor in het bereik van de 50 kDa receptor handel 8,9 wijzigen en deze techniek moeilijk te gebruiken met een lage expressie-niveau receptoren.
Andere procedures gebruiken verschillende methoden om intracellulaire mensenhandel compartimenten (bv endosomen, etc.) te identificeren en hun colokalisatie beoordelen met de receptoren van belang. Dit omvat de onse van heterologe systemen uiten fluorescerend eiwit-tag chimere constructen van de receptoren en compartiment markers (bijv Rab-familie GTPasen). Dit maakt mogelijk het gebruik van de live-cell imaging, het verwijderen van kwesties in verband met fixatie en permeabilisatie. Terwijl krachtige dergelijke strategie vertoont dezelfde beperkingen van heterologe systemen in het algemeen: tag en expressieniveau effecten op trafficking gedrag en onverenigbaarheid met fysiologisch representatieve celtypen. Meer in de volksmond, worden kleurstoffen gebruikt om eenvoudig intracellulaire compartimenten labelen (bijvoorbeeld lysosomen, ogenschijnlijk) 10. Kleurstoffen kunnen echter specificiteit (alle zure organellen bij kleurstoffen voor lysosomen) ontbreekt en geen handel niet beoordelen via andere compartimenten. Toch zijn deze technieken maken een aanzienlijke controle over het systeem en de experimentele omstandigheden en kunnen profiteren van de colocalization analysemethoden hier gepresenteerde, hieronder.
Werkwijze we hier aanwezig verfijnt het volgen van receptor mensenhandel door colocalization. Met behulp van immunocytochemie (ICC) passende markers label, is het mogelijk om meerdere verschillende intracellulaire compartimenten identificeren. Dit maakt ook het gebruik van fysiologisch relevante primaire celculturen in plaats van heterologe systemen. Deze ICC-protocol gaat vaststelling van de cellen van belang voorafgaand aan de etikettering; Dit maakt de etikettering op een bepaald tijdstip na behandeling met geneesmiddelen (s). Dit levert een 'snapshot' van de wereldwijde receptor-compartiment verenigingen op dat tijdstip. Met meerdere tijdstippen, kan een tijdsverloop van mensenhandel veranderingen ook worden gebouwd.
In het kort, cellen zijn drug-behandelde, gelabeld voor de receptor en intracellulaire compartiment van belang, confocally afgebeeld, en de microfoto's worden geanalyseerd om mathematisch kwantificeren colokalisatie van de receptor en compartiment 11. In onze toepassing, onderzochten we de colokalisatie van een receptor met Rab5, Rab11 en Lysosomale-geassocieerde membraaneiwit 1 (LAMP1). Deze markers te identificeren vroege endosomen, recycling endosomen en lysosomen, respectievelijk. Deze colocalization maatregelen fungeren als proxy voor de overkoepelende processen van internalisatie, recycling, en degradatie 12.
Zoals bij alle technieken moeten enige beperkingen worden overwogen. Vanwege de noodzaak beeld elk individu neuron geanalyseerd, kan deze techniek zeer arbeidsintensief zijn naargelang het aantal condities en tijdstippen betrokken. Alle immunokleuring moet ook kampen met de effecten op de cellulaire ultrastructuur, eiwit lokalisatie en epitoop toegankelijkheid veroorzaakt door fixatie en permeabilisatie 13.
Niettemin oorspronkelijk geoptimaliseerd voor primaire kweken van primaire sensorische neuronen, deze methode is grotendeels verenigbaar met andere monolaag uitgeplaat kweekmodellen.
Het gebruik van een mathematisch gekwantificeerde MEASURe van colocalization is, in het bijzonder, veel meer methodologisch strenger dan de vorige technieken die worden gebruikt om receptor mensenhandel veranderingen, die vaak hebben vertrouwd op vage, subjectieve maatregelen zoals visueel geïnspecteerd multi-channel overlays 14 beoordelen.
Deze techniek is bijzonder bruikbaar voor de brede compatibiliteit met in vivo acties (vóór primaire kweek generatie), in vitro interventies (in groeicultuur) en diverse kenmerken 15 richt. Als zodanig kan worden aangepast aan verschillende onderzoeksvragen.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben dit protocol voor de analyse van primaire kweken van volwassen dorsale wortel ganglion neuronen (primaire sensorische neuronen) geoptimaliseerd. Het kan ook worden toegepast met weinig of geen wijziging, voor monolaag gekweekte cellen uitgeplaat lijnen. De colocalizational analyse is ook mogelijk in het weefsel plakjes en andere dergelijke preparaten 11, maar de behandeling met geneesmiddelen en weefsel fixatie / voorbereiding componenten zou niet passend zijn.
Interessa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van CIHR (MOP394808) en een Canada Research Chair aan CMCEWO was de ontvanger van een Post-Graduate Scholarship van NSERC.
Materials
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps – Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2000 |
References
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Trafficking of G protein-coupled receptors. Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
- Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
- Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).
- Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
- Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
- Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
- Wang, H. -. B., Guan, J. -. S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
- Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
- He, S. -. Q., Zhang, Z. -. N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
- French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
- Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
- Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Field, A., Miles, J., Field, Z. . Discovering Statistics Using R. , (2012).
- Mattioli, T. -. A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22 (2010).
- Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
- Johnson, I., Spence, M. . The Molecular Probes Handbook. , (2010).
- Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
- Pawley, J. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).
