Suivi des modifications induites par la drogue dans des récepteurs post-internalisation traite par Analyse Colocalizational
Summary
le trafic de signalisation et module récepteur cellulaire réactivité aux ligands et est, elle-même, répondant à des conditions cellulaires, y compris la signalisation induite par le ligand. Ici, nous décrivons une technique puissante et flexible pour évaluer quantitativement le trafic des récepteurs induite par le médicament en utilisant immunomarquage et analyse colocalizational.
Abstract
The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.
Introduction
Les récepteurs, en particulier des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), sont couramment un trafic intracellulaire, et à partir de la surface de la cellule 1. Ces processus de façon complexe orchestrées et étroitement contrôlées dictent disponibles compléments de récepteurs de cellules et régulent l'activité du récepteur temporelle, la désensibilisation, et resensibilisation 2-4. Fait important, ces processus sont sensibles à des environnements cellulaires, y compris l'activité ou de l'inactivité récepteur induite par le médicament. Autrement dit, l'action des ligands au niveau des récepteurs peuvent modifier trafic intracellulaire de ces récepteurs, en modifiant ainsi la sensibilité des cellules. De cette manière, les ligands externes exercent encore plus d'effets sur la fonction de la cellule, au-delà même messager à effecteur cascades classiques 5,6.
Examen de tels changements dans le trafic des récepteurs induite est difficile. Toutes les techniques disponibles comportent des limitations. des essais de protection de la biotine ont été utilisés pour moniTor récepteurs de surface populations. Ces récepteurs sont biotinylés et un timecourse des immunoprécipitations sont effectuées afin de quantifier la réduction des récepteurs biotinylés au fil du temps. Cette technique surveille essentiellement la dégradation progressive d'une première, étiqueté, population de récepteurs 7, et est très utile dans la construction des cours à temps de ce processus. Malheureusement, cet essai est incapable de surveiller tout autre procédé que la dégradation de la piscine d'origine de récepteurs, tels que l'internalisation, le recyclage ou de nouveaux récepteurs. En outre, l'addition d'un anticorps dans la plage de 150 kDa à un récepteur dans la plage de 50 kDa peut modifier le trafic du récepteur 8,9, et cette technique peut être difficile à utiliser avec des récepteurs de faible niveau de l'expression.
D'autres procédures utilisent diverses méthodes pour identifier les compartiments de trafic intracellulaire (par exemple, les endosomes, etc.) et d'évaluer leur colocalisation avec les récepteurs d'intérêt. Cela inclut la nouse des systèmes hétérologues exprimant la protéine fluorescente-étiqueté constructions chimériques des récepteurs et des marqueurs du compartiment (GTPases par exemple, Rab-famille). Cela permet potentiellement l'utilisation de l'imagerie des cellules vivantes, en supprimant les questions relatives à la fixation et perméabilisation. Bien que puissant, une telle stratégie souffre des mêmes limitations des systèmes hétérologues en général: tag et le niveau d'expression des effets sur la traite des comportements et incompatibilité avec les types de cellules physiologiquement plus représentatifs. Plus populairement, les colorants sont utilisés pour étiqueter facilement compartiments intracellulaires (par exemple, les lysosomes, ostensiblement) 10. Colorants, cependant, peuvent manquer de spécificité (tous les organites acides dans le cas de colorants pour les lysosomes) et ne pas évaluer le trafic par d'autres compartiments. Pourtant, ces techniques permettent un contrôle considérable sur le système et les conditions expérimentales et peuvent bénéficier des méthodes d'analyse de colocalisation présentés ici, ci-dessous.
Procédé we présente ici affine le suivi du trafic des récepteurs par colocalisation. Utilisation immunocytochimie (ICC) pour étiqueter les marqueurs appropriés, il est possible d'identifier plusieurs compartiments intracellulaires distinctes. Ceci permet également l'utilisation de cultures de cellules primaires physiologiquement pertinentes en place des systèmes hétérologues. Ce protocole de la CPI consiste à fixer les cellules d'intérêt avant l'étiquetage; ce qui permet à un étiquetage spécifique timepoint après le traitement (s) de drogue. Cela produit un «instantané» des associations mondiales récepteur compartiments à ce point de temps. Avec de multiples points dans le temps, un timecourse des changements de trafic peut également être construit.
Brièvement, les cellules sont traités avec le médicament, pour le récepteur marqué et le compartiment intracellulaire d'intérêt, confocale imagé, et les microphotographies sont analysés pour quantifier mathématiquement colocalisation du récepteur 11 et le compartiment. Dans notre utilisation, nous avons examiné la colocalisation d'un récepteur avec Rab5, Rab11 et lysosomales-associated membrane protein 1 (LAMP1). Ces marqueurs identifient les endosomes précoces, les endosomes de recyclage, et les lysosomes, respectivement. Ces mesures de colocalisation agissent comme des procurations pour les processus généraux de l'internalisation, le recyclage, et la dégradation 12.
Comme avec toutes les techniques, certaines limites doivent être considérées. En raison de la nécessité d'image à chaque neurone individuel analysé, cette technique peut devenir assez de main-d'œuvre en fonction du nombre de conditions et de timepoints impliqués. Tous immunomarquage doit aussi composer avec les effets sur ultrastructure cellulaire, la localisation des protéines, et épitope accessibilité causés par la fixation et perméabilisation 13.
Bien que l'origine optimisé pour une utilisation avec des cultures primaires de neurones sensoriels primaires, cette méthode est largement compatible avec d'autres modèles de culture monocouche plaqué.
L'utilisation d'un mesur mathématiquement quantifiése de la colocalisation est, notamment, beaucoup plus rigoureuse au plan méthodologique que les techniques utilisées précédemment pour évaluer les changements de trafic de récepteurs, qui ont souvent compté sur des mesures subjectives vagues tels que visuellement inspectés superpositions multi-canal 14.
Cette technique est particulièrement utile pour sa large compatibilité avec les interventions in vivo (avant la génération de la culture primaire), interventions in vitro (pendant la croissance de la culture), et divers systèmes de marquage cible les 15. En tant que tel, il peut être adapté à de nombreux sujets de recherche différents.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons optimisé ce protocole pour l'analyse des cultures primaires de neurones de ganglions de la racine dorsale adultes (neurones sensoriels primaires). Il peut également être utilisé, avec peu ou pas de modification, par des cellules en culture monocouche plaqué au sens large. L'analyse colocalizational est également possible dans des tranches de tissu et d'autres telles préparations 11, mais les composants de traitement de la toxicomanie et de la fixation des tissus / préparation ne…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par une subvention des IRSC (MOP394808) et une chaire de recherche du Canada à CMCEWO était le récipiendaire d'une bourse d'études supérieures du CRSNG.
Materials
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps – Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2000 |
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