Colocalizational विश्लेषण द्वारा रिसेप्टर पोस्ट-internalization के अवैध व्यापार में दवा प्रेरित परिवर्तन पर नज़र रखने
Summary
रिसेप्टर की तस्करी ligands के लिए संकेतन और सेल जवाबदेही modulates और, खुद को, ligand प्रेरित सिगनल सहित सेल की स्थिति, के लिए उत्तरदायी है। यहाँ, हम मात्रात्मक immunolabeling और colocalizational विश्लेषण का उपयोग दवा प्रेरित रिसेप्टर की तस्करी का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली और लचीला तकनीक का वर्णन है।
Abstract
The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.
Introduction
रिसेप्टर्स, विशेष रूप से जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs), नियमित रूप से करने के लिए और कोशिका की सतह से 1, intracellularly तस्करी कर रहे हैं। ये मिश्रित रूप से करवाया और कसकर नियंत्रित प्रक्रियाओं 'कोशिकाओं उपलब्ध रिसेप्टर पूरक हुक्म और रिसेप्टर लौकिक गतिविधि, desensitization, और resensitization 2 विनियमित – 4। महत्वपूर्ण बात है, इन प्रक्रियाओं दवा प्रेरित रिसेप्टर गतिविधि या निष्क्रियता सहित सेलुलर वातावरण के लिए उत्तरदायी हैं। यही कारण है, रिसेप्टर्स पर ligands के कार्यों जिससे सेल जवाबदेही फेरबदल, उन रिसेप्टर्स के intracellular की तस्करी बदल सकते हैं। इस तरीके में, बाहरी ligands के भी शास्त्रीय दूत करने वाली प्रेरक Cascades 5,6 से परे है, और अधिक प्रभाव सेल समारोह पर अभी तक डालती है।
प्रेरित रिसेप्टर की तस्करी में इस तरह के बदलाव की जांच करना मुश्किल है। सभी उपलब्ध तकनीकों सीमाओं को शामिल करना। बायोटिन संरक्षण assays के मोनी करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैटो सतह रिसेप्टर्स आबादी। इन रिसेप्टर्स biotinylated कर रहे हैं और immunoprecipitations के timecourse समय के साथ biotinylated रिसेप्टर्स में कमी यों के लिए किया जाता है। इस तकनीक को अनिवार्य रूप से रिसेप्टर्स 7 की एक शुरुआती, लेबल, जनसंख्या का क्रमिक गिरावट पर नज़र रखता है, और इस प्रक्रिया के समय पाठ्यक्रम के निर्माण में बहुत उपयोगी है। दुर्भाग्य से, इस परख ऐसे internalization, रीसाइक्लिंग, या नए रिसेप्टर्स के रूप में रिसेप्टर्स के मूल पूल की गिरावट के अलावा अन्य किसी भी प्रक्रिया की निगरानी करने में असमर्थ है। इसके अलावा, 50kDa रेंज में एक रिसेप्टर के लिए 150kDa रेंज में एक एंटीबॉडी के अलावा रिसेप्टर के अवैध व्यापार 8,9 बदल सकते हैं, और इस तकनीक को कम अभिव्यक्ति-स्तर रिसेप्टर्स के साथ उपयोग करने के लिए मुश्किल हो सकता है।
अन्य प्रक्रियाओं इंट्रासेल्युलर तस्करी के डिब्बों (जैसे, endosomes, आदि) की पहचान करने और ब्याज की रिसेप्टर्स के साथ उनके colocalization का आकलन करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग करें। यह हमें भी शामिलव्यक्त heterologous प्रणालियों के ई रिसेप्टर्स और डिब्बे मार्कर (जैसे, रब-परिवार GTPases) की काइमेरिक निर्माणों फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग किया। इस संभावित निर्धारण और permeabilization से संबंधित मुद्दों को हटाने, लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग सक्षम बनाता है। अधिक physiologically प्रतिनिधि प्रकार की कोशिकाओं के साथ व्यवहार और असंगति तस्करी पर टैग और अभिव्यक्ति के स्तर प्रभाव: शक्तिशाली, वहीं ऐसी रणनीति heterologous सामान्य रूप में सिस्टम का एक ही सीमाओं से ग्रस्त है। और अधिक लोकप्रिय, रंग आसानी से intracellular डिब्बों लेबल करने के लिए उपयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए, लाइसोसोम, जाहिरा तौर पर) 10। रंजक, तथापि, विशिष्टता (लाइसोसोम के लिए रंगों के मामले में सभी अम्लीय अंगों) की कमी कर सकते हैं और अन्य डिब्बों के माध्यम से की तस्करी का आकलन नहीं करते। फिर भी, इन तकनीकों प्रणाली और प्रयोगात्मक शर्तों पर काफी नियंत्रण की अनुमति है और नीचे, यहाँ प्रस्तुत colocalization विश्लेषण के तरीकों से लाभ हो सकता है।
विधि Wयहां उपस्थित ई colocalization के द्वारा रिसेप्टर की तस्करी की ट्रैकिंग को परिष्कृत। उपयुक्त मार्करों लेबल करने के लिए immunocytochemistry (आईसीसी) का उपयोग करना, यह कई अलग intracellular डिब्बों की पहचान करना संभव है। यह भी heterologous सिस्टम के स्थान पर physiologically प्रासंगिक प्राथमिक सेल संस्कृतियों के उपयोग की अनुमति देता है। यह आईसीसी प्रोटोकॉल लेबलिंग करने से पहले ब्याज की कोशिकाओं फिक्सिंग शामिल है; इस दवा उपचार (एस) के बाद एक विशिष्ट timepoint पर लेबलिंग परमिट। यह उस timepoint पर वैश्विक रिसेप्टर डिब्बे संघों की एक स्नैपशॉट 'पैदा करता है। एकाधिक timepoints के साथ, तस्करी के बदलाव की एक timecourse भी निर्माण किया जा सकता है।
संक्षेप में, कोशिकाओं को दवा इलाज, रिसेप्टर और ब्याज के intracellular कम्पार्टमेंट के लिए चिह्नित कर रहे हैं, confocally imaged, और photomicrographs गणितीय रिसेप्टर और डिब्बे 11 की colocalization यों के लिए विश्लेषण कर रहे हैं। हमारे प्रयोग में, हम रा के साथ एक रिसेप्टर की colocalization की जांच कीB5, Rab11, और झिल्ली प्रोटीन 1 (LAMP1) lysosomal जुड़े। इन मार्कर क्रमशः, जल्दी endosomes, रीसाइक्लिंग endosomes, और लाइसोसोम की पहचान। ये colocalization के उपायों internalization, रीसाइक्लिंग, और गिरावट 12 के व्यापक प्रक्रियाओं के लिए परदे के पीछे के रूप में काम करते हैं।
सभी तकनीकों के साथ के रूप में, कुछ सीमाएँ विचार किया जाना चाहिए। कारण हर व्यक्ति के न्यूरॉन का विश्लेषण किया छवि के लिए जरूरत के लिए, इस तकनीक को शामिल शर्तों और timepoints की संख्या के आधार पर काफी श्रम प्रधान बन सकता है। सभी immunolabeling भी निर्धारण और permeabilization के 13 की वजह से सेलुलर फैटी, प्रोटीन स्थानीयकरण, और मिलान पहुँच पर प्रभाव के साथ संघर्ष करना होगा।
मूल रूप से प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृतियों के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित हालांकि, इस विधि अन्य monolayer चढ़ाया संस्कृति मॉडल के साथ मोटे तौर पर संगत है।
एक गणितीय मात्रा निर्धारित measur का उपयोगcolocalization की ई विशेष रूप से, कहीं अधिक methodologically, अक्सर ऐसे नेत्रहीन निरीक्षण किया मल्टी चैनल ओवरले 14 के रूप में अस्पष्ट, व्यक्तिपरक उपायों पर भरोसा किया है जो रिसेप्टर की तस्करी में परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल पिछले तकनीकों की तुलना में कठोर है।
इस तकनीक में विवो हस्तक्षेप (पूर्व प्राथमिक संस्कृति पीढ़ी) के साथ अपने व्यापक अनुकूलता के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, इन विट्रो हस्तक्षेप (संस्कृति के विकास के दौरान), और विभिन्न लेबलिंग 15 निशाना बनाता है। जैसे, यह कई अलग अलग अनुसंधान सवालों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम वयस्क पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स (प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स) के प्राथमिक संस्कृतियों के विश्लेषण के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलित है। यह भी मोटे तौर पर monolayer चढ़ाया संवर्धित कोशिकाओं के लिए, क?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम CIHR (MOP394808) और CMCEWO करने के लिए एक कनाडा अनुसंधान चेयर से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था NSERC से एक पोस्ट-ग्रेजुएट छात्रवृत्ति के प्राप्तकर्ता था।
Materials
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps – Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2000 |
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