Seguimiento de cambios inducidos por fármacos en los receptores post-internalización Trata de Análisis Colocalizational
Summary
El tráfico del receptor modula la señalización celular y la capacidad de respuesta a ligandos y es, en sí, que responda a las condiciones celulares, incluyendo la señalización inducida por ligando. A continuación, describimos una técnica poderosa y flexible para evaluar cuantitativamente el tráfico del receptor inducida por fármacos usando immunolabeling y análisis colocalizational.
Abstract
The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.
Introduction
Los receptores, en particular receptores acoplados a proteínas G (GPCRs), son objeto de tráfico rutinaria intracelularmente, hacia y desde la superficie de la célula 1. Estos procesos complejamente orquestadas y estrechamente controlados dictan complementos del receptor de células disponibles 'y regulan la actividad del receptor temporal, la desensibilización y resensibilización 2-4. Es importante destacar que estos procesos son sensibles a ambientes celulares, incluyendo la actividad del receptor inducida por fármacos o inactividad. Es decir, las acciones de los ligandos en los receptores pueden alterar el tráfico intracelular de estos receptores, alterando así la capacidad de respuesta celular. De esta manera, los ligandos externos ejercen aún más efectos sobre la función celular, incluso más allá clásicos cascadas-mensajero-efector a 5,6.
Examinar los cambios en el tráfico del receptor inducida es difícil. Todas las técnicas disponibles implican limitaciones. Ensayos de protección de biotina se han utilizado para monitor receptores superficiales poblaciones. Estos receptores están biotinilados y un timecourse de inmunoprecipitaciones se realiza para cuantificar la reducción en los receptores de biotina en el tiempo. Esta técnica esencialmente supervisa la degradación gradual de una inicial, marcado, la población de los receptores 7, y es muy útil en la construcción de cursos de tiempo de este proceso. Por desgracia, este ensayo no es capaz de controlar cualquier procedimiento distinto de la degradación de la piscina original de receptores, tales como la internalización, reciclado o nuevos receptores. También, la adición de un anticuerpo en el rango de 150 kDa a un receptor en la gama de 50 kDa puede alterar el tráfico del receptor de 8,9, y esta técnica puede ser difícil de usar con receptores de baja a nivel de expresión.
Otros procedimientos utilizan diversos métodos para identificar los compartimentos intracelulares de trata (por ejemplo, endosomas, etc.) y evaluar su colocalización con los receptores de interés. Esto incluye los EE.UU.e de los sistemas heterólogos que expresan la proteína fluorescente etiquetada-construcciones quiméricas de los receptores y los marcadores de compartimentos (GTPasas por ejemplo, Rab-familiares). Potencialmente, esto permite el uso de imágenes de células vivas, la eliminación de los problemas relacionados con la fijación y permeabilización. Mientras potente, una estrategia de este tipo adolece de las mismas limitaciones de los sistemas heterólogos en general: efectos de la etiqueta y el nivel de expresión en el tráfico de comportamiento y la incompatibilidad con los tipos de células fisiológicamente más representativos. Más popularmente, colorantes se utilizan para etiquetar fácilmente compartimentos intracelulares (por ejemplo, lisosomas, ostensiblemente) 10. Tintes, sin embargo, pueden carecer de especificidad (todos los organelos ácidos en el caso de los tintes para lisosomas) y no evaluar el tráfico a través de otros compartimentos. Sin embargo, estas técnicas permiten un control considerable sobre el sistema y las condiciones experimentales y pueden beneficiarse de los métodos de análisis de colocalización presentados aquí, a continuación.
El método we aquí presentes refina el seguimiento del tráfico de receptores por colocalización. Utilizando inmunocitoquímica (CPI) para etiquetar marcadores apropiados, es posible identificar múltiples compartimentos intracelulares distintas. Esto también permite el uso de cultivos celulares primarios fisiológicamente relevantes en lugar de sistemas heterólogos. Este protocolo CPI implica la fijación de las células de interés antes de etiquetado; esto permite que el etiquetado en una punto de tiempo específico después del tratamiento (s) de drogas. Esto produce una "instantánea" de las asociaciones mundiales receptor de compartimentos en ese punto de tiempo. Con múltiples puntos de tiempo, un timecourse de los cambios de tráfico también puede ser construido.
Brevemente, las células se etiquetan para el receptor y el compartimento intracelular de interés tratados con fármaco,, confocal fotografiado, y las fotomicrografías se analizan para cuantificar matemáticamente colocalización del receptor y el compartimiento 11. En nuestro uso, hemos examinado la colocalización de un receptor con Rab5, Rab11 y lisosomal-asociado proteína de membrana 1 (LAMP1). Estos marcadores identifican endosomas tempranos, endosomas de reciclaje, y lisosomas, respectivamente. Estas medidas colocalización actúan como sustitutos de los procesos generales de la internalización, el reciclaje y la degradación 12.
Al igual que con todas las técnicas, algunas limitaciones deben ser considerados. Debido a la necesidad de imagen cada neurona individual analizada, esta técnica puede llegar a ser bastante mano de obra en función del número de condiciones y puntos de tiempo implicados. Todo immunolabeling también debe lidiar con los efectos sobre la ultraestructura celular, localización de la proteína, y la accesibilidad epítopo causados por la fijación y permeabilización 13.
Aunque originalmente optimizada para su uso con cultivos primarios de neuronas sensoriales primarias, este método es ampliamente compatible con otros modelos de cultivo en monocapa-plateado.
El uso de un measur matemáticamente cuantificadoe de colocalización es, sobre todo, mucho más metodológicamente rigurosa que las técnicas anteriores utilizadas para evaluar los cambios de tráfico de los receptores, que a menudo se han basado en medidas subjetivas, vagas tales como superposiciones de varios canales visualmente inspeccionadas-14.
Esta técnica es particularmente útil para su amplia compatibilidad con intervenciones in vivo (antes de la generación de cultivo primario), intervenciones in vitro (durante el crecimiento del cultivo), y varios etiquetado objetivos 15. Como tal, se puede adaptar a muchas preguntas de investigación diferentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos optimizado el protocolo para el análisis de cultivos primarios de neuronas adultas ganglionares de la raíz dorsal (neuronas sensoriales primarias). También se puede utilizar, con poca o ninguna modificación, para células cultivadas en monocapa chapado ampliamente. El análisis colocalizational también es posible en cortes de tejido y otros tales preparaciones 11, sin embargo los componentes de tratamiento de drogas y la fijación del tejido / de preparación no sería apropiado.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca de CIHR (MOP394808) y una Cátedra de Investigación de Canadá para CMCEWO era el beneficiario de una Beca de Postgrado de NSERC.
Materials
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps – Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2000 |
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