En Aquatic Microbial Metaproteomics Arbeidsflyt: Fra celler til Tryptic Peptider Passer for Tandem massespektrometri basert analyse

Summary

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Abstract

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

Introduction

Mikroorganismer er allestedsnærværende og spille viktige roller i jordens biogeokjemiske sykluser ^1. For tiden er det mange molekylære metoder som er tilgjengelige for å karakterisere mikrobiell samfunnsstruktur og funksjon. Mest vanlig er analysen av 16S rRNA gensekvensene fra PCR-amplifisert DNA fra miljø ^{2 – 4.} En ulempe med 16S rRNA-genet analysen er at den bare gir informasjon om fylogenetisk identitet og samfunnsstruktur, med lite informasjon om metabolsk funksjon. I kontrast, tilnærminger som metagenomikk, metatranscriptomics og metaproteomics gi informasjon om samfunnsstruktur og metabolisme. Metagenomikk, eller analyse av genet innholdet av en samling av organismer, gir informasjon om strukturen og funksjonelle potensialet i samfunnet ^5-8. Selv kraftig, kan dette funksjonelle potensialet ikke samsvarer med den metabolskeaktiviteter av organismer. En organismes genotype er representert ved sine gener, som hver kan bli transkribert til RNA og ytterligere oversatt til protein, noe som resulterer i en fenotype. Derfor, for å hjelpe til i forståelsen av mikrobiell funksjonell aktivitet i et miljø, bør post-genomisk analyse bli utført ^ni. Metatranscriptomics, eller analyse av RNA-transkripter er nyttig fordi den avslører hvilke gener som er transkribert i et gitt miljø. Men ikke mRNA nivåer ikke alltid samsvarer med deres tilsvarende proteinnivåer på grunn av translasjonsforskning regulering, RNA halveringstid, og det faktum at flere protein kopier kan genereres for hver mRNA ^10.

Av disse grunner metaproteomics er nå anerkjent som et viktig verktøy for miljømikrobiologi. Felles metaproteomic analyserer bruke en hagle proteomikk tilnærming hvor nær full bemanning av proteiner i en kompleks prøve er renset og analysert samtidig, vanligvis gjennom enzymatic fordøyelse inn peptider og analyse på et massespektrometer. Etterfølgende tandem massespektrometri (MS / MS) "peptid fingerprinting" er brukt for å bestemme den peptidsekvens og potensielle protein er utstedt av protein databasesøk (for en oversikt se ^11). Proteomikk arbeidet har kommet langt de siste 25 årene takket være økningen i genomisk data tilgjengelighet og økningen i følsomhet og nøyaktighet massespektrometre slik at for høy gjennomstrømming protein identifisering og kvantifisering ^11,12. Ettersom proteiner er sluttproduktet av genekspresjon, kan metaproteomic dataene bidra til å bestemme hvilke organismer som er aktive i et gitt miljø, og hvilke proteiner de uttrykker. Dette er fordelaktig når man prøver å finne ut hvordan et bestemt sett av miljømessige variabler vil påvirke fenotypen av en organisme eller gruppe. Tidlig på, ble MS / MS-baserte metaproteomic studier i havet brukes til å identifisere spesifikke proteiner i målrettetmikrobielle slektsnavn, med den første studien fokuserer på lyset drevet protonpumpe proteorhodopsin i SAR11 marine bakterier ^13. Mer nylig har komparative metaproteomic analyser belyst differensial protein uttrykk mønstre mellom komplekse samfunn. Eksempler inkluderer identifisering av tidsmessige endringer i stoffskiftet i kystNorthWest Atlantic Ocean ^{14 eller} den antarktiske ^halvøya 5. Andre studier har beskrevet variasjoner i protein uttrykk mønstre på tvers av romlige skalaer, for eksempel langs en ​​geografisk transekt fra en lav-næringsstoff havet gyre til en svært produktiv kyst oppstrømning system ^15. For ytterligere vurderinger av metaproteomics anbefaler vi Schneider et al. (2010) ^{9 og} Williams et al. (2014) ^16. Målrettede proteomikk har også vært ansatt de siste årene for å kvantifisere uttrykket av spesifikke metabolske veier i miljøet ^17,18.

There er tre hovedfaser i metaproteomic analyse. Den første fasen er prøvepreparering, som omfatter prøvetaking, cellelysering og konsentrasjon av protein. Prøvetaking på marin mikrobiologi medfører ofte filtrering av sjøvann gjennom et forfilter for å fjerne større eukaryote celler, partikler og partikkelassosiert bakterier, fulgt av filtrering for fangst av frie levende mikrobielle celler, vanligvis ved anvendelse av et 0,22 um patron filterenheten ^19,20. Disse filtrene incased i en plastsylinder og en cellelyse og utvinning protein protokoll som kan utføres innenfor filterenheten vil være et verdifullt verktøy. Når biomassen er oppnådd, må cellene lyseres for å gi rom for proteinekstraksjon. Flere metoder kan anvendes, inkludert guanidin-HCl lyse ²¹ og natriumdodecylsulfat (SDS) -baserte lyseringsmetoder. Selv vaskemidler som SDS er svært effektiv på å forstyrre membraner og oppløsende mange proteintyper, concentrations så lavt som 0,1% kan forstyrre nedstrøms protein fordøyelse og MS analyse ^22. Av stor bekymring er de negative effektene av SDS på trypsin fordøyelsen effektivitet, oppløsningsevne omvendt fase væskekromatografi og ion undertrykkelse eller opphopning inne i ionekilde ^23.

Den andre fasen er fraksjonering og analyse, hvor proteinene blir utsatt for enzymatisk nedbrytning, etterfulgt av LC MS / MS-analyse, noe som resulterer i en m / z fragmenteringsmønster som kan brukes til å fastslå den primære aminosyresekvens av den innledende tryptiske peptid. Ulike fordøyelsen metoder kan utføres avhengig av hvilke typer rengjøringsmidler som brukes, samt nedstrøms massespektrometri arbeidsflyt. I protokollen, er en D-PAGE-elektroforese etterfulgt av fjerning av SDS fra gelen anvendt for å fjerne eventuell forurensning vaskemiddel. Analysen av proteiner som er vanskelige å oppløseliggjøre, slik som membranproteiner, krever bruk av høye konsensentrasjoner av SDS eller andre vaskemidler. Dette fører til kompatibilitetsproblemer med SDS-gel elektroforese. Dersom formålet med en studie krever oppløseliggjøring av disse vanskelig for å oppløse proteinene, kan rør-gelsystemet brukes ^22,24. Røret-gel metode omfatter proteiner i gelmatriksen uten bruk av elektroforese. Deretter noen rengjøringsmidler som brukes for oppløsning er fjernet før protein fordøyelse.

Den tredje fasen er det bioinformatisk analyse. I denne fasen MS / MS-peptid-data er søkt mot en database med oversatte nukleotidsekvenser for å bestemme hvilke peptider og proteiner er til stede i prøven. Identifiseringen av peptidene er avhengig av den database den er søkt mot. Marine metaproteomic data blir ofte søkte mot databaser som består av referanse genomer, metagenomic data som Global Ocean Sampling datasett ^25, samt encellete forsterket genom fra udyrket lineages ^26,27. Protein identifikasjon kan også økes ved å inkludere metagenomic sekvenser fra den samme prøven som metaproteomic data ble utledet ^5.

Her gir vi en protokoll for generering av peptider som er egnet for MS / MS-analyse basert fra mikrobiell biomasse som samles ved filtrering og lagret i en RNA stabilisering løsning. Protokollen er beskrevet her gjør det mulig for DNA og protein kan isoleres fra den samme prøven, slik at alle trinn som fører opp til protein og DNA-utfellinger er identiske. Fra et praktisk perspektiv, er mindre filtrering nødvendig siden bare ett filter er nødvendig for både protein og DNA-ekstraksjon. Vi ønsker også å erkjenne at denne protokollen ble skapt gjennom kombinasjonen, tilpasning og ombygging av to tidligere publiserte protokoller. De cellelysetrinn er tilpasset fra Saito et al. (2011) ^28, og den i-gel trypsin fordøye komponent er tilpasset fra ShevcheNKO et al. (2007) ^29.

Protocol

1. Forbered Reagenser Forbered SDS-utvinning løsning: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% glycerol, 10 mM EDTA og 1% SDS. Filter-sterilisere ved hjelp av en 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C. Forbered lager reagenser som er nødvendig for polyakrylamidgel. Forbered 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter-sterilisere ved hjelp av en 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved romtemperatur. 0,5 M Tris-HCl pH 6,8. Filter-sterilisere ved hjelp av en 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved r…

Representative Results

Som en demonstrasjon, utførte vi protokollen på to sjøvannsprøver samlet inn fra overflaten og klorofyll maksimalt kyst havet i Nord-Canada. Til sjøs, ble 6-7 liter sjøvann føres gjennom et 3 mikrometer GF / D forfilter, da mikrobielle celler ble samlet opp på en 0,22 um filterpatron enheten følge protokollen av Walsh et al., 20. Celler ble umiddelbart lagret i en RNA-stabilisering løsning inntil videre behandling. På vei tilbake til laboratoriet, utførte vi protokollen slik den er presen…

Discussion

Sample bevaring er nøkkelen til metaproteomic studier og tidligere arbeid vist at et RNA stabilisering løsning er en nyttig lagring buffer for lagring av celler før proteinekstraksjon ^28. Ideelt sett ville prøvene bli bevart in situ å oppheve endringer i proteinuttrykk under håndtering ^33,34. Faktisk, in situ prøvetaking og feste teknologi har blitt utviklet, noe som gir mulighet for den autonome innsamling og bevaring av prøver med skips utplassert instrumenter. Imidlerti…

Materials

Sterivex -GP 0.22 μm filter unit	Millipore	SVGP01050	Sampling
RNAlater Stabilization Solution	Ambion	AM7021	Sampling
Tris	Bio Basic	77-86-1 or TB0196-500G	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Protein Extraction
SDS	Bio Basic	15-21-3	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
EDTA	Bio Basic	6381-92-6	Protein Extraction
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Protein Extraction
10K Amicon Filter	Millipore	UFC801024	Protein Extraction
Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	Protein Precipitation
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1	Protein Precipitation
MPC Protein Precipitation reagent	Epicenter	mmP03750	DNA Precipitation
2-Propanol	Fisher Scientific	67-63-0	DNA Precipitation
Qubit dsDNA BR Assay kit	Life Technologies	Q32850	DNA Quantification
Qubit Protein Assay kit	Life Technologies	Q33211	Protein Quantification
Sucrose	Bio Basic	57-50-1	SDS PAGE gel
TEMED	Bio Rad	161-0800	SDS PAGE gel
APS	Bio Rad	161-0700	SDS PAGE gel
30% Acrylamide	Bio Rad	161-0158	SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	SDS PAGE gel
Glycine	Bio Rad	161-0718	SDS PAGE gel
B-mercaptoethanol	Bio Basic	60-24-2	SDS PAGE gel
Laemmli Sample Buffer	Bio Rad	161-0737	SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder	Bio Rad	161-0375EDU	SDS PAGE gel
Acetonitrile	VWR	CABDH6044-4	In-gel Trypsin digest
NH4HCO3	Bio Basic	1066-33-7	In-gel Trypsin digest
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	In-gel Trypsin digest
Formic Acid	Sigma-Aldrich	F0507-500ML	In-gel Trypsin digest
HPLC grade H2O	Sigma-Aldrich	270733-4L	In-gel Trypsin digest
Iodoacetamide	Bio Basic	144-48-9	In-gel Trypsin digest
Trypsin	Promega	V5111	In-gel Trypsin digest
Protein LoBind Tube 1.5ml	Eppendorf	22431081	In-gel Trypsin digest
2mL ROBO vial 9mm	Candian Life Science	VT009/C395SB	In-gel Trypsin digest
PP BM insert, No spring	Candian Life Science	4025P-631	In-gel Trypsin digest