Un microbienne aquatique métaprotéomique Workflow: à partir de cellules à tryptique peptides appropriés pour l'analyse comparative-spectrométrie de masse en tandem

Summary

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Abstract

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

Introduction

Les microorganismes sont omniprésents et jouent des rôles essentiels dans les cycles biogéochimiques de la Terre ^1. Actuellement, il existe de nombreuses approches moléculaires disponibles pour caractériser la structure de la communauté microbienne et la fonction. La plus courante est l'analyse du gène ARNr 16S séquences amplifié par PCR de l'ADN de l'environnement ^{2 – 4.} Un inconvénient de l'analyse du gène ARNr 16S est qu'elle ne fournit des informations sur l'identité phylogénétique et structure de la communauté, avec peu d'informations sur la fonction métabolique. En revanche, les approches telles que la métagénomique, metatranscriptomics et métaprotéomique fournissent des informations sur la structure des communautés et le métabolisme. La métagénomique, ou l'analyse de la teneur en gène d'un assemblage d'organismes, fournit des informations sur la structure et le potentiel fonctionnel de la communauté ^5-8. Bien que puissant, ce potentiel fonctionnel peut ne pas correspondre à la métaboliqueactivités des organismes. Le génotype d'un organisme est représenté par ses gènes, dont chacun peut être transcrit en ARN et traduit en outre à la protéine, ayant pour résultat un phénotype. Ainsi, pour aider à la compréhension de l'activité fonctionnelle microbienne dans un milieu, l'analyse post-génomique doit être effectué ^neuf. Metatranscriptomics, ou l'analyse des transcrits d'ARN est utile car elle révèle que gènes sont transcrits dans un environnement donné. Cependant, les taux d'ARNm ne correspondent pas toujours aux niveaux correspondants de protéines due à une régulation de la traduction, la demi-vie d'ARN, et le fait que des copies multiples de la protéine peuvent être générées pour chaque ARNm ^10.

Pour ces raisons métaprotéomique est maintenant reconnu comme un outil important pour la microbiologie environnementale. Metaproteomic commune analyses utiliser une approche protéomique fusil de chasse où le plein complément près de protéines dans un échantillon complexe sont purifiés et analysés simultanément, généralement par le biais frla digestion zymatic en peptides et des analyses sur un spectromètre de masse. Après la spectrométrie de masse (MS / MS) "empreintes de peptide» est utilisé pour déterminer la séquence des peptides et des protéines potentiel d'origine par la base de données de recherche de protéines (pour une revue voir ^11). Travaux protéomique a parcouru un long chemin dans les 25 dernières années grâce à l'augmentation de la disponibilité de données génomiques et l'augmentation de la sensibilité et la précision des spectromètres de masse permettant à haut débit l'identification des protéines et la quantification ^11,12. Puisque les protéines sont le produit final de l'expression des gènes, les données metaproteomic peuvent aider à déterminer quels organismes sont actifs dans un environnement donné et ce que les protéines qu'ils expriment. Ceci est avantageux lorsque vous essayez de déterminer comment un ensemble particulier de variables environnementales aura une incidence sur le phénotype d'un organisme ou d'une communauté. Dès le début, les études metaproteomic base-MS / MS dans l'océan ont été utilisés pour identifier des protéines spécifiques dans ciblélignées microbiennes, avec la première étude mettant l'accent sur ​​la lumière axée sur la pompe à protons protéorhodopsine dans SAR11 bactéries marines ^13. Plus récemment, des analyses comparatives metaproteomic ont élucidé les profils d'expression différentielle des protéines complexes entre les communautés. Les exemples incluent l'identification des décalages temporels dans le métabolisme du littoral Atlantique Nord-Ouest ^{14 ou} la péninsule antarctique ^5. D'autres études ont décrit des variations dans les modes d'expression de protéines à travers les échelles spatiales, par exemple, le long d'un transect géographique d'un gyre océanique faible en éléments nutritifs à un système d'upwelling côtier très productif ^15. Pour de plus amples commentaires de métaprotéomique nous recommandons Schneider et al. (2010) ^{9 et} Williams et al. (2014) ^16. Protéomique ciblée a également été employés au cours des dernières années pour quantifier l'expression des voies métaboliques spécifiques dans l'environnement ^17,18.

There sont trois phases principales dans l'analyse metaproteomic. La première phase est la préparation des échantillons, qui comprend la collecte de l'échantillon, la lyse des cellules et la concentration de protéine. Prélèvement de l'échantillon en microbiologie marine entraîne souvent la filtration de l'eau de mer à travers un pré-filtre pour éliminer les cellules eucaryotes plus grandes particules et les bactéries de particules associé, suivie d'une filtration pour la capture de cellules microbiennes vivant libres, communément avec l'utilisation d'une cartouche de 0,22 pm unité de filtre ^19,20. Ces filtres sont incased dans un cylindre en plastique et une lyse cellulaire et la protéine protocole d'extraction qui peut être effectuée à l'intérieur de l'unité de filtration, il est un outil précieux. Une fois la biomasse est obtenue, les cellules doivent être lysées pour permettre l'extraction de la protéine. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées, y compris la guanidine-HCl sulfate lyse ²¹ et le sodium dodécyl (SDS) méthodes de lyse à base. Bien que des détergents comme SDS sont très efficaces à perturber les membranes et solubilisation de nombreux types de protéines, concentrations dons aussi faible que 0,1% peut interférer avec la digestion des protéines en aval et l'analyse MS ^22. De préoccupation majeure est les effets négatifs de SDS sur l'efficacité de la digestion de la trypsine, la puissance de la chromatographie inverse en phase liquide et la suppression d'ions ou de l'accumulation à l'intérieur de la source d'ions ²³ résoudre.

La deuxième phase est le fractionnement et d'analyse, où les protéines sont soumises à une digestion enzymatique suivie d'une analyse LC MS / MS, entraînant schéma de fragmentation am / z qui peut être utilisé pour déterminer la séquence d'acides aminés primaire du peptide tryptique initial. Divers procédés de digestion peut être effectuée en fonction des types de détergents utilisés, ainsi que la spectrométrie de masse en aval flux de travail. Dans notre protocole, une électrophorèse PAGE-D suivie de l'élimination du SDS à partir du gel est utilisé pour enlever toute contamination de détergent. L'analyse de protéines qui sont difficiles à solubiliser, tels que des protéines membranaires, nécessite l'utilisation de haute concentrations de SDS ou d'autres détergents. Cela conduit à des problèmes de compatibilité avec l'électrophorèse SDS-gel. Si l'objectif d'une étude nécessite la solubilisation de ces durs pour solubiliser les protéines, le système de tube de gel peut être utilisé ^22,24. Procédé tube gel comprend moins de protéines de la matrice de gel sans l'utilisation d'électrophorèse. Par la suite des détergents utilisés pour la solubilisation sont retirés avant la digestion des protéines.

La troisième phase est l'analyse bioinformatique. Dans cette phase, les données de peptide MS / MS sont recherchées contre une base de données de séquences nucléotidiques traduites de déterminer quels sont les peptides et les protéines présentes dans l'échantillon. L'identification des peptides dépend de la base de données contre il est recherché. Metaproteomic données marines sont généralement recherchées contre les bases de données comprenant des génomes de référence, les données métagénomiques tels que le jeu de données mondial océan échantillonnage ^25, ainsi que des génomes de cellules amplifié simples de li incultesneages ^26,27. Identification des protéines peut également être augmentée par l'inclusion de séquences metagénomiques partir du même échantillon que les données metaproteomic ⁵ a été dérivée.

Ici, nous fournissons un protocole pour la production de peptides appropriés pour l'analyse comparative MS / MS à partir de biomasse microbienne recueilli par filtration et stockées dans une solution de stabilisation de l'ARN. Le protocole décrit ici permet d'ADN et de protéines pour être isolés à partir du même échantillon de sorte que toutes les étapes menant à la protéine et les précipitations ADN sont identiques. D'un point de vue pratique, moins filtration est nécessaire, car un seul filtre est nécessaire à la fois pour les protéines et l'extraction d'ADN. Nous tenons également à souligner que ce protocole a été créé grâce à la combinaison, l'adaptation et la modification des deux protocoles précédemment publiés. Les étapes de lyse des cellules sont adaptées de Saito et al. (2011) ²⁸ et la trypsine dans le gel digérer composant est conçu à partir de Shevchenko et al. (2007) ^29.

Protocol

1. Préparer Réactifs Préparer la solution de SDS-extraction: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% de glycerol, 10 mM d'EDTA et 1% de SDS. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C. Préparer les réactifs sous licence nécessaires au gel de Polyacrylamide. Préparer 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à température ambiante. 0,5 M de Tris-HCl pH 6,8. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 u…

Representative Results

Comme une démonstration, nous avons effectué le protocole sur deux échantillons d'eau de mer prélevés dans la surface et le maximum de la chlorophylle de l'océan côtier dans le Nord canadien. En mer, l'eau de mer 7/6 L a été passé à travers un 3 um GF / D préfiltre, puis les cellules microbiennes ont été recueillis sur un filtre à cartouche de 0,22 pm en suivant le protocole de Walsh et al. 20. Les cellules ont été immédiatement stockés dans une solution de stabilisatio…

Discussion

Exemple de préservation est essentielle pour metaproteomic études et des travaux antérieurs ont démontré que la solution de stabilisation de l'ARN est un tampon de stockage pour stocker des cellules utile avant l'extraction des protéines ^28. Idéalement, les échantillons seraient conservés in situ pour annuler des changements dans l'expression des protéines pendant la manipulation ^33,34. En effet, in situ technologies d'échantillonnage et de fixation ont …

Materials

Sterivex -GP 0.22 μm filter unit	Millipore	SVGP01050	Sampling
RNAlater Stabilization Solution	Ambion	AM7021	Sampling
Tris	Bio Basic	77-86-1 or TB0196-500G	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Protein Extraction
SDS	Bio Basic	15-21-3	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
EDTA	Bio Basic	6381-92-6	Protein Extraction
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Protein Extraction
10K Amicon Filter	Millipore	UFC801024	Protein Extraction
Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	Protein Precipitation
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1	Protein Precipitation
MPC Protein Precipitation reagent	Epicenter	mmP03750	DNA Precipitation
2-Propanol	Fisher Scientific	67-63-0	DNA Precipitation
Qubit dsDNA BR Assay kit	Life Technologies	Q32850	DNA Quantification
Qubit Protein Assay kit	Life Technologies	Q33211	Protein Quantification
Sucrose	Bio Basic	57-50-1	SDS PAGE gel
TEMED	Bio Rad	161-0800	SDS PAGE gel
APS	Bio Rad	161-0700	SDS PAGE gel
30% Acrylamide	Bio Rad	161-0158	SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	SDS PAGE gel
Glycine	Bio Rad	161-0718	SDS PAGE gel
B-mercaptoethanol	Bio Basic	60-24-2	SDS PAGE gel
Laemmli Sample Buffer	Bio Rad	161-0737	SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder	Bio Rad	161-0375EDU	SDS PAGE gel
Acetonitrile	VWR	CABDH6044-4	In-gel Trypsin digest
NH4HCO3	Bio Basic	1066-33-7	In-gel Trypsin digest
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	In-gel Trypsin digest
Formic Acid	Sigma-Aldrich	F0507-500ML	In-gel Trypsin digest
HPLC grade H2O	Sigma-Aldrich	270733-4L	In-gel Trypsin digest
Iodoacetamide	Bio Basic	144-48-9	In-gel Trypsin digest
Trypsin	Promega	V5111	In-gel Trypsin digest
Protein LoBind Tube 1.5ml	Eppendorf	22431081	In-gel Trypsin digest
2mL ROBO vial 9mm	Candian Life Science	VT009/C395SB	In-gel Trypsin digest
PP BM insert, No spring	Candian Life Science	4025P-631	In-gel Trypsin digest