Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

Summary

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.

Abstract

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) da fibroblasti cutanei adulti e la successiva differenziazione in cellule somatiche fornisce prospettive affascinanti per la derivazione dei trapianti autologhi che aggirano le barriere di istocompatibilità. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e la successiva differenziazione completa in linee desiderati rimane un posto di blocco per la traduzione clinica della tecnologia IPSC a causa del potenziale neoplastico e genomica instabilità associata. Recentemente, noi e gli altri dimostrato che le cellule somatiche non possono essere convertiti in iPSCs ma anche in diversi tipi di cellule staminali somatiche multipotenti solo utilizzando fattori definiti, eludendo così la progressione attraverso lo stato pluripotente. In particolare, la conversione diretta di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali indotte (iNPCs) prelude alla possibilità di una fonte di cellule autologhe romanzo per varie applicazioni come la sostituzione delle cellule, modelli di malattiae lo screening di stupefacenti. Qui, descriviamo l'isolamento di adulti fibroblasti primari umani da biopsia cutanea e la loro conversione diretta efficace in iNPCs di espressione tempestivo ristretto di Oct4, Sox2, Klf4, così come c-Myc. Colonie neuroepiteliale Sox2-positivi compaiono dopo 17 giorni di induzione e linee INPC possono essere stabiliti in modo efficiente isolamento monoclonale ed espansione. Regolazione precisa della molteplicità di infezione virale e l'integrazione della leucemia fattore inibitorio durante la fase di induzione rappresentano fattori critici per raggiungere efficienze di conversione fino al 0,2%. Finora, le linee INPC specifici del paziente potrebbero essere ampliati per più di 12 passaggi e uniforme mostrano caratteristiche morfologiche e molecolari delle cellule staminali / progenitrici neurali, come l'espressione di nestina e Sox2. Le linee INPC possono essere differenziate in neuroni e astrociti come giudicato dalla colorazione contro TUJ1 e GFAP, rispettivamente. In conclusione, riportiamo un protocollo robusto per la derivazione e terribileconversione ct di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali stabilmente espandibili che potrebbero fornire una fonte cellulare per applicazioni biomediche come autologo sostituzione delle cellule neurali e modelli di malattia.

Introduction

Nel 2006 Yamanaka e colleghi potrebbero mostrare per la prima volta la possibilità di riprogrammazione delle cellule somatiche in uno stato pluripotente ^1. Questo dedifferentiation è stato raggiunto da sovraespressione di quattro fattori di trascrizione Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc in fibroblasti murini. Le generati cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) mostrano l'equivalenza funzionale alle cellule staminali embrionali (ESC) e possono quindi essere differenziati in tutti i tipi di cellule dell'organismo adulto. Un anno dopo la riprogrammazione di iPSCs potrebbe essere realizzata anche per fibroblasti umani ^2. Gli esperimenti in modelli animali dimostrano che le cellule IPSC derivati ​​vengono generalmente usate per la terapia cellulare di sostituzione, per esempio, in malattia di Parkinson (PD) ^3-5. Tuttavia, alcune limitazioni associate con l'uso di iPSCs rappresentano ostacoli per la piena realizzazione del loro potenziale terapeutico. Prima di tutto, riprogrammazione delle cellule in uno stato pluripotente e successivacontrollo di qualità è generalmente un tempo e processo inefficiente cedevole in ampi e quindi costose procedure di coltura cellulare. In secondo luogo, iPSCs bisogno di essere ri-differenziate nel tipo cellulare desiderato di interesse prima applicazione biomedica e la probabilità di cellule pluripotenti residue nella popolazione differenziata porti un significativo potenziale oncogeno e visualizza quindi un elevato rischio dopo il trapianto di cellule ^6. In terzo luogo, il processo di riprogrammazione viene ottenuto inducendo i fattori di riprogrammazione da infezioni lenti- o retrovirale. L'integrazione di questi virus nel genoma dell'ospite potrebbe portare a mutagenesi inserzionale e / o riattivazione incontrollata dei transgeni ^7,8. I sistemi non integrativi sono stati sviluppati per fornire i fattori di riprogrammazione di cellule bersaglio, che riducono al minimo il rischio di mutagenesi inserzionale e transgene riattivazione. Esempi di questi approcci senza transgene sono la riprogrammazione delle cellule utilizzando non l'integrazioneAdeno o il virus di Sendai ^9,10, basati sul DNA vettori ¹¹ o l'applicazione di metodi senza DNA, come la transfezione di mRNA sintetico ¹² o trasduzione di proteine ​​ricombinanti ^13,14. Un altro metodo promettente per la derivazione del libero-transgene IPSC è l'uso di costrutti riprogrammazione lentivirali loxP modificati e la successiva eliminazione dei transgeni che utilizzano il sistema di ricombinazione Cre-loxP DNA ^15,16.

Un approccio più semplice per generare cellule neurali per la terapia di sostituzione cellulare rappresenta conversione diretta dei fibroblasti in neuroni post-mitotico ^17-20. Vierbuchen et al. Riferito che la sovraespressione di fattori di trascrizione Ascl1, Brn2 e Myt1l risultati nella generazione di 20% neuroni da fibroblasti murini ^17. Nel 2011 è stato dimostrato, che gli stessi tre fattori di trascrizione in combinazione con sovraespressione di NeuroD1 permettono transdifferenziazione di fibroblasti umani in neuRons ^19. Umani indotta neuroni potrebbero essere generati anche da sovraespressione di Ascl1 e Ngn2 sotto dual SMAD- e GSK3β- inibizione ^20. In particolare, la conversione diretta dei fibroblasti in neuroni genera una popolazione di cellule post-mitotico non proliferativa che non consente ulteriori espansioni e biobanche.

Recentemente, la conversione diretta dei fibroblasti in una popolazione di cellule neurali staminali / progenitrici proliferazione è stato segnalato ^21-26. Per motivi di chiarezza, tutti questi tipi cellulari saranno nominati come cellule progenitrici neurali indotte (iNPCs) in questo rapporto. Han et al. Sovraespresso Brn4, Sox2, c-Myc e Klf4 per generare iNPCs. Come i loro omologhi di cellule staminali neurali derivate da cellule o tessuti primaria o pluripotenti questi iNPCs sono tripotential e potrebbero essere differenziate in neuroni, astrociti e oligodendrociti ^21. Il nostro gruppo ha un protocollo di conversione leggermente diversa che coinvolge sovraespressione di Sox2, Klf4E c-Myc e indotta Oct4-espressione per 5 giorni soltanto. Con questo approccio si potrebbe generare stabilmente proliferanti iNPCs da murine embrionali e adulte fibroblasti che presentano completo silenziamento della riprogrammazione fattori ^22. In contrasto con iPSCs, iNPCs non presentano un potenziale cancerogeno dopo il trapianto ^27. Abbiamo usato le cellule convertito con successo in un modello animale di demielinizzazione, ratti privi di mielina, dimostrando che iNPCs sono clinicamente utili ^22. Fino ad allora, gli NPC possono essere generati solo da cellule staminali pluripotenti o tessuto neurale primaria ^28-32. iNPCs sono cellule stabilmente espandibili che possono essere crioconservati e sono in grado di differenziarsi in neuroni, astrociti e oligodendrociti. Sono stati compiuti molti sforzi per adattare il protocollo conversione diretta da mouse per cellule umane ^23,26,33,34. Nel 2012 è stato pubblicato che la sovraespressione del singolo fattore Sox2 nei fibroblasti è sufficiente a generare murine e umane iNPCs <sup> 33. Gli autori hanno riferito generazione di iNPCs umani da fibroblasti prepuzio fetali e caratterizzati dalla colorazione contro Sox2 e Nestin. Tuttavia, le cellule bersaglio utilizzate per la riprogrammazione rappresentano un particolare tipo di cellule che non sarà disponibile nella pratica clinica e non vi era alcuna caratterizzazione funzionale delle cellule trasformate da trapianto in un modello animale eseguita. Una pubblicazione più recente descrive la generazione dei progenitori neuronali ristrette da fibroblasti fetali umane da sovraespressione di Sox2, c-Myc e sia Brn2 o Brn4 ^34. Le linee di cellule generate hanno mostrato capacità di auto-rinnovamento e potrebbero essere differenziate in vari tipi di neuroni terminali. Tuttavia, l'utilizzo di fibroblasti fetali è sfavorevole, poiché queste cellule sono di origine eterogenea e non si può escludere la presenza di residui esempio, cellule staminali della cresta neurale nei preparati. Nel 2014, Zhu et al. Riportarono la conversione diretta di umano adulto e neonatale fibroblasti in cellule progenitrici neurali tripotential di sovraespressione di Sox2 insieme con Oct4 o Oct4 da solo e l'aggiunta di piccole molecole ai media di coltura cellulare. In particolare, in base al loro studi Sox2 solo non era sufficiente per indurre conversione diretta ^26. Più recentemente, Lu et al., Ha riferito che la sovraespressione della Yamanaka fattori Oct4-, Sox2-, Klf4-, c-Myc dal virus Sendai per 24 ore e successiva inattivazione del virus da un aumento di temperatura risultati nella generazione di espandibile neurale tripotential cellule precursori ^23. In conclusione, anche se i protocolli di conversione pubblicati per le cellule umane finora hanno in comune la sovraespressione di almeno uno o più dei fattori Yamanaka, spesso in modo tempestivo ristretta, non vi è alcuna chiara indicazione dei fattori molecolari minimi necessari per guidare diretta conversione in iNPCs. La sovraespressione tempestivo limitato di Oct4 genetici, con mezzi, trasfezione con mRNA sintetico, oppure cproteine ​​ell permeanti insieme con l'espressione costitutiva di Sox2, Klf-4, e c-Myc, non ha dato luogo a linee umane stabili INPC ancora. Pertanto, l'applicazione di virus Sendai a overexpress tutti fattori Yamanaka e tempestive limitare la loro attività mediante inattivazione termica del virus ²³ unitamente alle condizioni di induzione neurale multimediali ottimizzate ^22,31 rappresenta la strategia preferita finora.

Diversi studi dimostrano la funzionalità cellulare di cellule staminali neurali o dei loro omologhi differenziate in diversi modelli di malattie degli animali. Progenitori neurali da cellule staminali umane pluripotenti sono state trapiantate in modelli murini della malattia neuroinfiammatoria sclerosi multipla ^35,36. L'applicabilità di cellule progenitrici neurali hESC-derivati ​​in EAE (encefalomielite autoimmune sperimentale) -mice stato mostrato nel 2008 ^35. Cellule precursori neurali multipotenti sono state iniettate nei ventricoli del cervello di topo, e il risultato del trapiantocato nella riduzione dei segni clinici di EAE. Kim et al. Generato precursori oligodendrogliali di hESC e trapiantato quelli intracerebroventricolare in EAE-topi. Anche se il trapianto non sopravvissero per più di 10 giorni, i topi hanno mostrato un miglioramento significativo della funzione neurologica e la riduzione delle cellule immunitarie proinfiammatorie nella sostanza bianca ^36. Terapia con cellule staminali è stato applicato anche per il targeting preclinico della malattia di Parkinson come PNG potrebbero essere impiegati con successo nei rispettivi modelli animali. Per questo, le cellule progenitrici sono stati derivati ​​da tessuto cerebrale fetale ³⁷ differenziate da cellule staminali pluripotenti ^38-40 o cellule staminali mesenchimali ⁴¹ sono state usate. Nel 2012 abbiamo dimostrato che iNPCs mouse sono in grado di produrre la proteina proteolipid, la principale componente proteica mielina, dopo il trapianto nel cervello di mielina-deficienti (md) ratti ^22. Con questo esperimento prova di principio del applicabil terapeuticalità di iNPCs primo luogo è stato provato e subito confermata da un altro studio ^32. Tuttavia, il pieno potenziale di uso terapeutico di iNPCs umani rimane da esplorare.

Qui vi mostriamo un processo affidabile e integrata di (i) derivazione di cellule primarie umane da pazienti adulti tramite biopsia della pelle, (ii) la conversione diretta di fibroblasti umani in uno stato progenitore neuronale e (iii) la capacità di iNPCs essere differenziati in neuronale e lignaggi gliali. L'utilizzo di questo protocollo contribuirà ad accelerare la generazione di cellule umane autologhe per applicazioni terapeutiche.

Protocol

I fibroblasti umani utilizzati in questo studio sono stati ottenuti da una biopsia cutanea dopo essersi informato consenso e la clearance etico dal comitato etico dell'Università di Würzburg, Germania (rapporto etico no: 96/11 del 10.06.2011). 1. Punch Biopsia Disinfettare la pelle del paziente. Anestetizzare parte della pelle di cui biopsia sarà presa da (preferibilmente una zona esposta al sole meno) con 0,5 a 1 ml di mepivacaina cloridrato intracutaneously e preparare bi…

Representative Results

Qui vi presentiamo una descrizione di un processo integrato che permette la generazione di cellule indotte neurali progenitrici (iNPCs) da fibroblasti umani che sono stati ottenuti da una biopsia di pelle in meno di 8 settimane (Figura 1). INPCs paziente-specifc possono essere ulteriormente differenziati in lignaggi neuronali e gliali e porto un enorme potenziale per la terapia di sostituzione cellulare e modelli di malattia. L'infezione dei fibroblasti con Oct4-, Klf4-,…

Discussion

Qui vi mostriamo l'isolamento e la conversione diretta di fibroblasti umani in cellule progenitrici neurali senza transgene espandibili e la loro progenie differenziata come base putativo per la terapia cellulare di sostituzione o l'applicazione in analisi lo screening di stupefacenti. Conversione lineage diretta di cellule somatiche nel NPC è stato ottenuto mediante espressione forzata di trascrizione specifici lineage fattori ^26,33,34. Tuttavia, in molti casi fibroblasti fetali sono stati usati per…

Materials

Astrocyte media	ScienCell	1801
B27	LifeTechnologies	17504-044
BDNF	Peprotech	450-02
Biopsy Punch	pfm medical	48301
cAMP	Sigma	A6885
CHIR99021	Axon medchem	1386
Collagenase Type2	Worthington Biochemical	LS004177
Dispase	PAN	P10-032100
DMEM	LifeTechnologies	41966-029
DMEM F12	LifeTechnologies	11320-033
DMSO	Roth	4720
DPBS	LifeTechnologies	14190-094
EGF	Life Technologies	PHG0313
FCS	Biochrom AG	50115
GDNF	Peprotech	450-10
Gentamicin	Sigma	G1397
GFAP-antibody	Dako	Z0334
GlutaMAX	LifeTechnologies	35050-038
hLIF	Peprotech	300-05
Insulin	Seralab	GEM-700-112-P
Ki67-antibody	NeoMarkers	RM-9106-S
L-Glutamine	LifeTechnologies	25030-024
Laminin	Sigma	L2020
N2	LifeTechnologies	17502-048
Nestin-antibody	R&D Systems	MAB1259
Neurobasal	LifeTechnologies	21103-049
Non-essential amino acids	LifeTechnologies	11140-050
NSC freezing media	Sigma	C6295
Oct4-antibody	Santa Cruz	sc9081
Pax6-antibody	Covance	PRB-278P
SB431542	Invivogen	inh-sb43
Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit	LifeTechnologies	A1378001
Sodiumpyruvate	Life Technologies	11360-039
Sox1-antibody	R&D Systems	AF3369
Sox2-antibody	R&D Systems	MAB2018
T3	Santa Cruz	sc-205725
Trypsin/EDTA	Life Technologies	15400-054
TUJ1-antibody	Covance	MMS-435P-250
Vitamin C	Sigma	A4544
Y27632	Calbiochem	CAS 146986-50-7
β-Mercaptoethanol	LifeTechnologies	21985023