16S rRNAのをターゲットジゴキシン標識DNAプローブを用いたパラフィン包埋組織内細菌のその場検出で
Summary
Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Abstract
The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Introduction
細菌は、歯周炎、歯髄炎、歯冠周囲炎、蜂巣炎、骨髄炎などの様々な口腔疾患の病因における役割を果たしています。疾患の病因における細菌の役割を理解し、治療の効果を監視するために、組織内の細菌の局在化は重要です。歯周炎患者からの歯肉組織内の細菌の存在は、蛍光-を用いたin situハイブリダイゼーション （FISH）8 の細菌に特異的な抗体3-7、および蛍光を用いて、電子顕微鏡1,2を含む様々な方法を用いて、免疫組織化学および免疫蛍光が示されています16S rRNAのをターゲットに標識されたオリゴヌクレオチドプローブ。それにもかかわらず、これらの方法は広く、技術的制限または困難に使用されていません。抗体と比較して、16SのrRNAを標的とするプローブを生成し、種特異性を達成することは容易です。 FISHはBACTの可視化のための優れたツールであることが証明されましたこのようなプラークバイオフィルムとしての自然環境でERIA。しかし、組織サンプルのFISHの適用は、様々な組織成分の自己蛍光に限定されます。彼らは9出血含むとき、例えば、赤血球の強い自己蛍光は、しばしば、炎症組織への蛍光技術の適用を妨げます。
炎症を起こした歯肉組織内の細菌を局在化するためには、従って、ジゴキシゲニン（DIG）を用いたin situハイブリダイゼーション法での DNAプローブの開発に成功10,11に適用された標識。 Pを使用してパラフィン包埋組織内の細菌の局在化のためここでは詳細なプロトコールジンジバリス特異的およびユニバーサル真正細菌プローブが記載されています。同様の結果は、他の研究室で再現することができるように、これは、特に方法の標準化に焦点を当てています。このプロトコルは、その組織学的コンテキストとRESU内細菌の局在化を可能にしますLTSは非常に再現性があります。説明されたプロトコルのいずれかの様々な組織における種特異的または普遍方法で細菌をローカライズするために使用することができます。ユニバーサルプローブは、多菌性疾患中の細菌を検出すると、特定の細菌の役割は知られていない疾患における細菌の潜在的な役割を研究するために特に有用です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで、DIG標識DNAプローブを用いてパラフィン包埋組織内の細菌をローカライズするためのプロトコルが記載されています。プローブは、細菌の16S rRNA遺伝子のDNAまたはRNA分子を標的とし、16S rRNAの標的プローブは、いずれかの種特異的または普遍として設計することができます。 P.の特異的ハイブリダイゼーションP.ジンジバリスに対する特異的プローブジンジバリスで?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、韓国国立研究財団からの助成金（2013R1A1A3005669）と韓国の医療技術のR＆Dプロジェクト、保健福祉省の補助金（HI13C0016）によってサポートされていました。
Materials
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
References
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