In Situ påvisning av bakterier innenfor parafininnleiret Vev Bruke en digoksin-merket DNA Probe målretting 16S rRNA

Summary

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Abstract

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Introduction

Bakterier spiller en rolle i etiologien av forskjellige orale sykdommer så som periodontitt, pulpitt, perikoronitt, cellulitt, og osteomyelitt. For å forstå rollen til bakterier i patogenesen av sykdom og for å overvåke effekten av behandlinger, er lokaliseringen av bakterier i vevet viktig. Nærvær av bakterier i gingival vev fra pasienter med periodontitt har blitt vist ved hjelp av forskjellige metoder, inkludert elektronmikroskopi ^1,2, immunohistokjemi og immunfluorescens ved å bruke bakterie spesifikke antistoffer ^3-7 og fluorescerende in situ hybridisering (FISH) ⁸ ved hjelp av en fluorescence- merket oligonukleotidprobe målretting 16S rRNA. Likevel er disse metodene ikke mye brukt på grunn av tekniske begrensninger eller vanskeligheter. Sammenlignet med antistoffer, sonder målretting 16S rRNA er enkle å produsere og oppnå arts spesifisitet. FISH har vist seg å være et utmerket verktøy for visualisering av bacteria i sine naturlige miljøer som plakk biofilm. Imidlertid, anvendelse av fisk til vevsprøver er begrenset på grunn av forskjellige autofluorescens vevskomponenter. For eksempel, den sterke autofluorescens av røde blodceller hemmer ofte anvendelse av fluorescens-teknologi for å betent vev når de involverer blødning ^9.

For å lokalisere bakterier i betente gingivale vev, og derfor en in situ-hybridisering ved anvendelse av en digoksigenin (DIG) -merket DNA-probe er blitt utviklet og anvendt med suksess ^10,11. Her en detaljert protokoll for lokalisering av bakterier i parafininnstøpte vev ved bruk av P. gingivalis-spesifikke og universelle eubakterielle onder har blitt beskrevet. Det er spesielt fokusert på standardisering av metoden, slik at lignende resultater kan reproduseres i andre laboratorier. Denne protokollen tillater lokalisering av bakterier innenfor deres histologisk kontekst og results er reproduserbar. Den beskrevne protokoll kan benyttes for å lokalisere bakteriene enten i en artsspesifikk eller universell måte i forskjellige vev. Den universelle probe er spesielt nyttig for å påvise bakterier i polymikrobielle sykdommer og for å undersøke en mulig rolle av bakterier i sykdommer hvor rollen til spesifikke bakterier er ikke kjent.

Protocol

1. Probe Forberedelse PCR-amplifisering av sonden For P. gingivalis -spesifikk probe, forsterke et 343-bp DNA-fragment av P. gingivalis 16S rRNA ved PCR ved anvendelse av genomisk DNA fra P. gingivalis og følgende primere: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'og 5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3' 10. Utfør amplifikasjoner med følgende syklusbetingelser: 35 sykluser ved 95 ° C i 30 sek, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 1 min 20 sek, etterfulgt av…

Representative Results

Figur 1 viser dot-blotting av DIG-merkede prober, sammenlignet med den positive kontroll-proben tilgjengelig i settet for å bestemme deres følsomhet. Den 343 bp P. gingivalis -spesifikk probe er 25 ganger mer følsom enn 70 bp eubakterielle probe. Figur 2 viser in situ hybridisering av gingival vev oppnådd fra pasienter med kronisk periodontitt for påvisning av P. gingivalis og eubacteria. Bakterie signaler, som er vist i fiolett, ble påvist i det epitel,…

Discussion

Her en protokoll for å lokalisere bakterier i parafininnstøpte vev ved bruk av et DIG-merket DNA-probe er blitt beskrevet. Sonden retter seg mot det DNA- eller RNA-molekyler av bakterielle 16S rRNA-genet, og 16S rRNA-målretting prober kan utformes enten som artsspesifikk eller universell. Den spesifikke hybridisering av P. gingivalis -spesifikk sonde til P. gingivalis, men ikke til andre orale bakterier er tidligere vist ^10. I motsetning til dette, det eubakterielle probe hybridisert til …

Materials

Acetic anhydride	Sigma	6404
50% Dextran sulfate solution	Millipore	S4030
50X Denhardt’s solution	Sigma	D2532
DEPC	Sigma	P159220
DIG DNA labeling and detection kit	Roche	11 093 657 910
Formamide	Sigma	F9037
ImmEdge™ Pen	Dako	H-400
Levamisole	Vector	SP-5000
Magnesium chloride	Sigma	246964
Maleic acid	Sigma	M0375
Methyl green	Sigma	M6776
Paraformaldehyde	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Salmon sperm DNA solution	Invitrogen	#15632-011
Sodium chloride	Sigma	S9625
Sodium citrate	Duksan	D1420
Sodium dodecyl sulfate	Amresco	227
Triethanolamine-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Research organics	3098T