同期を必要とせずに、フローサイトメトリーを用いた細胞周期の進行の時間追跡
Summary
このプロトコルは、特定の時点でS期にあった細胞の時間的な追跡を可能にするために、ブロモデオキシウリジン（BrdUの）取り込みの使用が記載されています。 DNA色素と抗体標識の添加は、後の時点でS期細胞の運命の詳細な分析を容易にします。
Abstract
This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.
Introduction
細胞周期の進行の間に細胞内で起こる細胞周期の機能と変更点の評価は、生物学の多くの側面、特に癌の生物学を理解するための基本です。悪性腫瘍の治療のために開発中の多くの薬剤は、細胞周期の進行に大きな影響を持っているか、細胞周期依存性の機構を介して、細胞死を誘導します。細胞周期の特定の期における細胞周期動態または細胞を研究するためには、細胞を同期させることが一般的です。しかし、同期化方法は、潜在的に得られた結果を混乱させる、研究された細胞に有害な影響を有し得る。1近年、細胞周期の特定の段階でのみ存在する蛍光タグ付きタンパク質の使用は、時間をかけて、単一細胞における細胞周期進行の分析を可能にしました2、ただし細胞は遺伝的にこれを読み取ることができるシステムへの使用を制限する、これらの標識タンパク質を発現するように操作する必要性を検討しますILY達成。
細胞周期は、2つのアクティブフェーズで構成されています細胞分裂が起こる合成DNAが複製される（S）相、有糸分裂（M）を。これらの相は3ギャップ相、G 0、G 1及びG 2で分離されています。 G 0または休止は、細胞は、細胞が前のDNA複製および細胞増殖は、DNA複製の完了との間が、細胞分裂の前に続けてG 2のサイズの増加ここで、G 1は 、周期を離れた休止期です。細胞周期の進行は、チェックポイントの数によって制御されます。環境条件がDNA合成の支援ではなく、S期への進入を防止するときG 1チェックポイントが活性化されます。イントラS期チェックポイントまたは遅延は、停止した複製フォークで生じ得るDNA損傷によって誘発することができます。 G 2の間、複製されたDNAの忠実性が確認され、損傷をG 2、検出された場合</サブ>チェックポイントは、前の細胞分裂にDNA修復を可能にする活性化されます。有糸分裂の間の最終的なチェックポイントは、細胞分裂が正常に完了することができるように、染色分が正常に分裂プレートに整列されていることを保証します。これらのチェックポイントの3活性化は、一般的に細胞集団を同期するために使用されます。細胞周期チェックポイントは、多くの要因によって活性化することができるが、癌生物学において最も一般的には、DNA損傷の検出です。 DNA損傷応答はPI3キナーゼ様キナーゼ毛細血管拡張性運動失調およびRAD3関連（ATR）は、それぞれ、下流のエフェクターキナーゼのChk1およびChk2での活性化血管拡張性失調症変異した（ATM）によって開始される。3イベントの範囲は、ストールを含めたChk1を活性化させます複製フォーク、DNAの架橋、および紫外線損傷はChk2では、主に二本鎖切断によって活性化されます。
細胞周期iの長さに変更された条件の影響を研究するための通常の方法細胞周期の特定の段階において細胞を同期させるための1本は、いくつかの方法を介して達成することができます。細胞は、物理的サイズ、密度、側方散乱（粒度）、および細胞表面マーカーの発現に基づいて分離することができます。具体的には、細胞は、化学的手段によって同期させることができます。チミジン、ヒドロキシ尿素及びシトシンアラビノシドのようないくつかの薬剤は、薬剤が除去された後に循環を続けるS期における細胞の蓄積を生じ、細胞周期のS期におけるDNA合成を阻害するために使用することができます。またはM期のDNA含量-有糸分裂紡錘体、G 2と逮捕の形成を防止するノコダゾール、で処理した細胞。 G 0期の細胞の蓄積培地結果から血清の排除。培養血清中の栄養素の再添加は、細胞の正常な循環を再起動します。しかし、これらの同期方法の全ては、細胞の正常な循環と成長を妨害することが可能とresul有意な細胞死でT。
急性リンパ芽球性白血病細胞の同期は特に困難であり、これらの細胞は、遺伝子操作に適していません。ここで説明する方法は、細胞周期動態の評価と、従来の同期または遺伝子改変することなく、細胞周期の特定の段階にある細胞の研究を可能にします。この方法は、遺伝子改変し、従来の同期手順は容易に達成されていない他の細胞型のために有用であり得ます。この方法は、細胞の短期の成長および増殖にはほとんど影響を与えブロモデオキシウリジン（BrdUの）取り込み、長い確立使用に基づいている。4設立のBrdUプロトコルはS期の間に新たに合成されたDNAへのBrdUの取り込みを利用します。これは恒久的にBrdU露光中、S期にあったように、細胞をマークします。この集団は、BrdUのincorporために染色することにより、後の時点で識別することができエーション、それにより追跡し、細胞周期の通過に対する薬物効果の研究を可能にする時間をかけて評価することができる同期集団として機能します。 BrdUを通常DNアーゼまたは酸処理した後の達成、前抗体染色にさらされる必要がある。6,7取り込まれたBrdUは、追加のマーカーを含めることができ検出するために、フローサイトメトリーを使用しました。最も重要なのは、試験の開始時にS期にあった細胞の細胞周期分布の評価を可能にする、DNA含有量を測定するための色素の使用である。8さらに、追加の表面または細胞内抗原はまた、研究することができる。9、これらなどのKi67として、またはそのような切断されたカスパーゼ3のようなアポトーシスマーカーとしての一見無関係な細胞機能への細胞周期のイベントに関連してもよいです。潜在的な用途は、研究者の想像力によって制限されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞周期を分析する能力は、癌生物学および細胞増殖と成長に影響を与える両薬物および遺伝子の作用機序を理解するために重要です。報告によると、細胞増殖を測定するアッセイの多数がありますが、大半は単に本数細胞を示す尺度を提供します。これらは、直接可視化、カウント、代謝活性またはATP濃度によって細胞数を測定するアッセイが含まれます。これらの方法の多くの主な利点?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was funded by the Leukemia and Lymphoma Society of the USA (6105-08), a Cancer Council NSW grant (13-02), an NHMRC Senior Research Fellowship (LJB) (1042305) and project grant (1041614).
Materials
| APC BrdU Flow Kit | BD Biosciences | 552598 | Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer) |
| BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus | BD Biosciences | 561651 | Referred to as Permeabilization buffer |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | Referred to as Wash buffer |
| DNase | Sigma | D-4513 | |
| BD Falcon 12 x 75-mm FACS tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| BD Pharmingen Stain Buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| BD LSR FORTESSA flow cytometer | BD Biosciences | FORTESSA | |
| Pipetman | Gilson | P2, P20, P100, P1000 | |
| RPMI 1640 w/o L-Gln 500 ml | Lonza | 12-167F | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| Fetal Bovine Serum | FisherBiotec | FBS-7100113 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002-1G | |
| Falcon TC 150cm2 vented Flasks | BD Biosciences | 355001 | |
| Pipettes 25mL | Greiner | 760180 | |
| Aersol Pipettes 200µL | Interpath | 24700 | |
| Aersol Pipettes 1mL | Interpath | 24800 | |
| Centrifuge | Spintron | GT-175R | |
| CO2 incubator | Binder | C 150 | |
| AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody | Cell Signalling | 9708S | |
| Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2197S | |
| Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2348S | |
| NALM6 | DSMZ | ACC-128 |
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