تتبع الزمني للتقدم دورة الخلية باستخدام التدفق الخلوي دون الحاجة إلى مزامنة
Summary
يصف هذا البروتوكول استخدام bromodeoxyuridine (BrdU) امتصاص للسماح تتبع الزمني للخلايا التي كانت في المرحلة S في نقطة محددة في الوقت المناسب. إضافة الأصباغ الحمض النووي ووضع العلامات الأجسام المضادة تسهل تحليل مفصل لمصير الخلايا مرحلة S في أوقات لاحقة.
Abstract
This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.
Introduction
تقييم ميزات دورة الخلية والتغيرات التي تحدث في الخلايا أثناء تقدم دورة الخلية هو أمر أساسي لفهم جوانب كثيرة من الأحياء، لا سيما بيولوجيا السرطان. العديد من وكلاء في التنمية لعلاج الأورام الخبيثة يكون لها آثار عميقة على تقدم دورة الخلية أو لحث على موت الخلايا عبر دورة الخلية الآليات التي تعتمد على. من أجل دراسة ديناميات دورة الخلية أو الخلايا في مرحلة معينة من مراحل دورة الخلية، ومن المعتاد لمزامنة الخلايا. ومع ذلك أساليب التزامن يمكن أن يكون لها آثار ضارة على خلايا التي تجري دراستها، يحتمل أن يفند النتائج التي تم الحصول عليها. 1 تحليل الآونة الأخيرة استخدام البروتينات الموسومة fluorescently التي تكون موجودة إلا في مراحل معينة من دورة الخلايا ويسمح للتقدم دورة الخلية في الخلايا واحد على مر الزمن 2، إلا أن الخلايا لدراستها الحاجة إلى معالجته وراثيا للتعبير عن هذه البروتينات الموسومة مما يحد من وإلى أنظمة حيث هذا يمكن قراءةحققت إيلي.
تتكون دورة الخلية من مرحلتين النشطة: مرحلة التوليف (S)، حيث يتم نسخ DNA والانقسام (M) حيث انقسام الخلية تأخذ مكان. يتم فصل هذه المراحل من خلال ثلاث مراحل الفجوة، G 0، G 1 و 2 G. G 0 أو السكون، هو مرحلة الراحة حيث ترك الخلية دورة، G 1 حيث تزيد من الخلايا في الحجم قبل تكرار الحمض النووي وG 2 حيث يستمر نمو الخلايا بين الانتهاء من تكرار الحمض النووي ولكن قبل انقسام الخلية. يتم التحكم في تطور من خلال دورة الخلية من قبل عدد من نقاط التفتيش. تنشيط G 1 نقطة تفتيش عندما تكون الظروف البيئية ليست داعمة لتخليق DNA ويمنع دخول مرحلة S. ويمكن أن تظهر نقطة تفتيش المرحلة داخل S أو تأخير من قبل الحمض النووي من التلف الذي قد يؤدي إلى تكرار الشوك المتوقفة. خلال G 2 تأكيد الإخلاص من الحمض النووي تتكرر وإذا تم الكشف عن الأضرار ثم G 2 </يتم تنشيط الفرعي> نقطة تفتيش سمحت إصلاح الحمض النووي قبل انقسام الخلايا. A نقطة تفتيش النهائي خلال الانقسام يضمن أن الصبغيات تم محاذاة بشكل صحيح في لوحة الإنقسامية حتى يمكن الانتهاء من هذا الانقسام الخلوي بنجاح. يستخدم 3 تفعيل هذه الحواجز عادة لمزامنة السكان الخلية. نقاط التفتيش دورة الخلية يمكن تفعيلها من خلال عدد من العوامل ولكن في بيولوجيا السرطان الأكثر شيوعا هو الكشف عن الحمض النووي من التلف. تبدأ الاستجابة الحمض النووي من التلف من قبل مثل PI3 كيناز توسع الشعريات تحركات ترنح وRad3 ذات الصلة (ATR) وترنح توسع الشعيرات تحور (ATM) التي تنشط تحركات المستجيب المصب Chk1 وChk2، على التوالي. 3 وهناك مجموعة من الأحداث ينشط Chk1 بما المتوقفة تكرار الشوك، crosslinks DNA، وأضرار الأشعة فوق البنفسجية في حين يتم تنشيط Chk2 المقام الأول عن طريق الكسر مزدوج الحبل.
الطريقة المعتادة لدراسة تأثير الظروف المتغيرة على طول ط دورة الخليةالصورة لمزامنة الخلايا في مرحلة معينة من مراحل دورة الخلية. 1 وهذا لا يمكن أن يتحقق من خلال عدة طرق. الخلايا يمكن جسديا منعزلة على أساس الحجم والكثافة، مبعثر الجانب (التفاصيل)، وعلامات التعبير سطح الخلية. أكثر عمليا، قد تكون متزامنة الخلايا عن طريق الوسائل الكيميائية. عدة عوامل مثل الثيميدين، هيدروكسي يوريا والسيتوزين الأرابينوزيد يمكن أن تستخدم لتثبيط تخليق DNA في المرحلة S من دورة الخلية مما يؤدي إلى تراكم الخلايا في مرحلة S التي لا تزال ركوب الدراجات بعد إزالة العوامل. خلايا تعامل مع نوكودازول، الذي يمنع تشكيل المغزل الإنقسامية والاعتقال مع G 2 – أو M-مرحلة محتوى الحمض النووي. القضاء على المصل من نتائج مستنبت في تراكم الخلايا في G 0 المرحلة. إعادة بالإضافة للمغذيات داخل المصل ثقافة إعادة يبدأ ركوب الدراجات العادية للخلايا. ومع ذلك، كل من هذه الأساليب تزامن تتداخل مع ركوب الدراجات العادية ونمو الخلايا ويمكن بالنتيجهتي في موت الخلايا كبيرة.
تزامن خلايا سرطان الدم الليمفاوي الحاد هو تحديا من نوع خاص، وهذه الخلايا ليست قابلة للتلاعب الجيني. الطريقة الموصوفة هنا يسمح تقييم ديناميكيات دورة الخلية ودراسة الخلايا في مراحل معينة من دورة الخلية دون تزامن التقليدي أو التعديل الوراثي. هذه الطريقة قد تكون مفيدة لأنواع الخلايا الأخرى التي لم تتحقق التعديل الوراثي وتزامن الإجراءات التقليدية بسهولة أيضا. وتستند هذه الطريقة على استخدام عريقة من bromodeoxyuridine (BrdU) التأسيس، والذي له تأثير ضئيل جدا على النمو على المدى القصير وتكاثر الخلايا. 4 بروتوكولات BrdU تأسست الاستفادة من إدماج BrdU الى الحمض النووي مركبة جديدة خلال المرحلة S . هذا يمثل بشكل دائم الخلايا بأنها كانت في المرحلة S أثناء التعرض BrdU. يمكن التعرف على هذه الفئة من السكان في نقطة زمنية لاحقة من قبل تلطيخ لBrdU incorporأوجه، وبالتالي يكون بمثابة السكان متزامنة التي يمكن اتباعها وتقييمها على مر الزمن السماح دراسة آثار المخدرات على دورة الخلية العبور. يحتاج BrdU أن تتعرض قبل تلوين الأجسام المضادة، التي تحققت عادة بعد الدناز أو العلاج حامض. 6،7 عن طريق التدفق الخلوي للكشف BrdU أدرجت يمكن إدراج علامات إضافية. والأهم هو استخدام الأصباغ لقياس محتوى الحمض النووي، مما يتيح تقييم دورة الخلية توزيع المرحلة من الخلايا التي كانت في المرحلة S في بداية الدراسة. ويمكن أيضا 8 السطح أو داخل الخلايا المستضدات وعلاوة على ذلك إضافية دراستها. 9 هذه قد تتعلق بأحداث دورة الخلية مثل Ki67 أو ميزات الخلية لتبدو غير ذات صلة مثل علامات موت الخلايا المبرمج مثل المشقوق كاسباس 3. التطبيقات المحتملة محدودة من الخيال المحقق.
Protocol
Representative Results
Discussion
القدرة على تحليل دورة الخلية هي مهمة لفهم بيولوجيا السرطان وآلية عمل كل من المخدرات والجينات التي تؤثر على تكاثر الخلايا والنمو. في حين أن هناك العديد من المقايسات التي يقال قياس تكاثر الخلايا، فإن الغالبية لا توفر سوى مقياس يشير إلى خلايا العدد الحالي. وتشمل هذه الم…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was funded by the Leukemia and Lymphoma Society of the USA (6105-08), a Cancer Council NSW grant (13-02), an NHMRC Senior Research Fellowship (LJB) (1042305) and project grant (1041614).
Materials
| APC BrdU Flow Kit | BD Biosciences | 552598 | Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer) |
| BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus | BD Biosciences | 561651 | Referred to as Permeabilization buffer |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | Referred to as Wash buffer |
| DNase | Sigma | D-4513 | |
| BD Falcon 12 x 75-mm FACS tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| BD Pharmingen Stain Buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| BD LSR FORTESSA flow cytometer | BD Biosciences | FORTESSA | |
| Pipetman | Gilson | P2, P20, P100, P1000 | |
| RPMI 1640 w/o L-Gln 500 ml | Lonza | 12-167F | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| Fetal Bovine Serum | FisherBiotec | FBS-7100113 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002-1G | |
| Falcon TC 150cm2 vented Flasks | BD Biosciences | 355001 | |
| Pipettes 25mL | Greiner | 760180 | |
| Aersol Pipettes 200µL | Interpath | 24700 | |
| Aersol Pipettes 1mL | Interpath | 24800 | |
| Centrifuge | Spintron | GT-175R | |
| CO2 incubator | Binder | C 150 | |
| AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody | Cell Signalling | 9708S | |
| Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2197S | |
| Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2348S | |
| NALM6 | DSMZ | ACC-128 |
References
- Banfalvi, G., Banfalvi, G. . Methods Mol Biol. 761, 1-23 (2011).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Harper, J. W., Elledge, S. J. The DNA damage response: ten years after. Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).
- Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218, 474-475 (1982).
- Carayon, P., Bord, A. Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA. Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).
- Gonchoroff, N. J., et al. S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment. Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).
- Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells. Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).
- Hendzel, M. J., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106, 348-360 (1997).
- Draetta, G., Beach, D. Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement. Cell. 54, 17-26 (1988).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. , (2012).
- Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester. Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).
- Beck, H. P. Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine. Cytometry. 2, 170-174 (1981).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells. Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).
- Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67. Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).
- Danova, M., et al. Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors. Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).
- Juan, G., et al. Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis. Cytometry. 32, 71-77 (1998).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).
- Kues, W. A., et al. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors. Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).
- Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization. Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).
