Monitoraggio temporale del ciclo cellulare progressione citometria a flusso, senza la necessità di sincronizzazione
Summary
Questo protocollo descrive l'uso di bromodeossiuridina (BrdU) uptake per consentire il monitoraggio temporale di cellule che erano in fase S in un determinato momento. L'aggiunta di coloranti DNA e l'etichettatura degli anticorpi facilita l'analisi dettagliata del destino delle cellule in fase S in tempi successivi.
Abstract
This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.
Introduction
La valutazione delle caratteristiche del ciclo cellulare e cambiamenti che si verificano nelle cellule durante la progressione del ciclo cellulare è fondamentale per capire molti aspetti della biologia, in particolare biologia del cancro. Molti agenti di sviluppo per il trattamento di tumori maligni hanno effetti profondi sulla progressione del ciclo cellulare o indurre la morte cellulare per ciclo cellulare dipendente-meccanismi. Per studiare la dinamica del ciclo cellulare o cellule in una particolare fase del ciclo cellulare, si è soliti sincronizzare cellule. Tuttavia metodi di sincronizzazione possono avere effetti negativi sulle cellule in fase di studio, potenzialmente confondere i risultati ottenuti. 1 analisi Recentemente l'uso di proteine con tag fluorescenza che sono presenti solo in determinati fasi del ciclo di cellule hanno permesso di progressione del ciclo cellulare in cellule singole nel tempo 2, tuttavia le cellule da studiare bisogno di essere manipolato geneticamente per esprimere queste proteine taggati, limitando il loro utilizzo ai sistemi in cui questo può essere lettoily raggiunto.
Il ciclo cellulare è costituito da due fasi attive: la fase di sintesi (S), in cui il DNA si replica e la mitosi (M), dove la divisione cellulare si svolge. Queste fasi sono separate da tre fasi gap, G 0, G 1 e G 2. G 0 o quiescenza, è una fase di riposo in cui la cellula ha lasciato il ciclo, G 1 è dove le cellule aumentano di dimensione prima replicazione del DNA e G 2 dove la crescita cellulare continua tra il completamento della replicazione del DNA ma prima divisione cellulare. La progressione attraverso il ciclo cellulare è controllato da una serie di punti di controllo. Il G 1 checkpoint si attiva quando le condizioni ambientali non sono favorevoli della sintesi del DNA e impedisce l'entrata in fase S. La fase di checkpoint o ritardo intra-S possono essere attivati da danni al DNA che può provocare forche replica stallo. Durante G 2 la fedeltà del DNA replicato è confermata e se il danno è rilevato poi il G 2 </sub> checkpoint è attivata permettendo la riparazione del DNA prima di divisione cellulare. Un punto di controllo finale durante la mitosi assicura che cromatidi sono state allineate correttamente la piastra mitotico in modo che la divisione cellulare può essere completata con successo. 3 L'attivazione di questi punti di controllo è comunemente usato per sincronizzare popolazioni cellulari. Checkpoint del ciclo cellulare possono essere attivati da una serie di fattori, ma in biologia del cancro il più comune è il rilevamento dei danni al DNA. La risposta al danno al DNA è iniziata dalla PI3-chinasi-like chinasi telangiectasia atassia e RAD3 connessi (ATR) e atassia telangiectasia mutato (ATM) che attivano chinasi effettori a valle Chk1 e CHK2 rispettivamente. 3 una serie di eventi attiva Chk1 compresi stallo forche replica, legami crociati DNA, e danni radiazione ultravioletta mentre Chk2 è attivata principalmente da rotture del doppio filamento.
Il metodo usuale per studiare l'effetto di mutate condizioni della lunghezza del ciclo cellulare is per sincronizzare le cellule in una particolare fase del ciclo cellulare. 1 Ciò può essere ottenuto mediante diversi metodi. Le celle possono essere fisicamente separate in base alle dimensioni, densità, dispersione laterale (granularità), e marcatori di espressione di superficie cellulare. Più in concreto, le cellule possono essere sincronizzati con mezzi chimici. Diversi agenti come timidina, citosina arabinoside e idrossiurea possono essere utilizzati per inibire la sintesi del DNA nella fase S del ciclo cellulare risultante in un accumulo di cellule nella fase S che continuano ciclismo dopo che gli agenti sono rimossi. Le cellule trattate con nocodazole, che impedisce la formazione del fuso mitotico, l'arresto a G 2 – o M-fase contenuto di DNA. Eliminazione di siero dai risultati medi cultura in accumulo di cellule in G 0 fase. Tale aggiunta dei nutrienti nei siero cultura ri-avvia il normale bicicletta delle cellule. Tuttavia, tutti questi metodi di sincronizzazione interferisce con il ciclismo normale e la crescita delle cellule e possono Result significativa morte cellulare.
La sincronizzazione delle cellule di leucemia linfoblastica acuta è particolarmente impegnativo e queste cellule non sono suscettibili di manipolazione genetica. Il metodo qui descritto consente di stimare le dinamiche del ciclo cellulare e lo studio delle cellule in particolari fasi del ciclo cellulare senza sincronizzazione tradizionale o modificazione genetica. Questo metodo può anche essere utile per altri tipi di cellule in cui la modificazione genetica e procedure di sincronizzazione tradizionali non sono facilmente ottenibili. Il metodo si basa sull'uso consolidata di bromodeossiuridina (BrdU), che ha un impatto sulla crescita a breve termine e la proliferazione delle cellule. 4 protocolli BrdU fondazione sfruttano l'incorporazione di BrdU nel DNA di nuova sintesi in fase S . Questo segna definitivamente le cellule come dopo essere stato in fase S durante l'esposizione BrdU. Questa popolazione può essere identificato in momenti successivi con la colorazione per BrdU Incorporzione e quindi agiscono come una popolazione sincronizzato che può essere seguito e valutati nel corso del tempo permettendo lo studio degli effetti dei farmaci sul transito del ciclo cellulare. BrdU deve essere esposto prima della colorazione degli anticorpi, di solito raggiunti per DNasi o trattamento con l'acido. 6,7 citometria a flusso per rilevare BrdU incorporata consente l'inserimento di altri marker. La più importante è l'uso di coloranti per misurare il contenuto di DNA, consentendo la valutazione del ciclo cellulare distribuzione di fase delle cellule che erano in fase S all'inizio dello studio. 8 Inoltre aggiuntivi antigeni di superficie o intracellulari possono essere studiate. 9 Questi possono riguardare eventi del ciclo cellulare, come Ki67 o funzioni cellulari per apparentemente non correlate, come marcatori di apoptosi, come spaccati caspasi-3. Le potenziali applicazioni sono limitate dalla fantasia del ricercatore.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacità di analizzare il ciclo cellulare è importante per la comprensione della biologia del cancro e il meccanismo di azione di entrambi i farmaci e geni che influenzano la proliferazione e la crescita cellulare. Mentre ci sono una moltitudine di saggi che misurano riferito proliferazione cellulare, la maggioranza solo fornire una misura che indica le cellule numerici presenti. Questi includono test che misurano il numero di cellulare per la visualizzazione diretta e il conteggio, l'attività metabolica o la …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was funded by the Leukemia and Lymphoma Society of the USA (6105-08), a Cancer Council NSW grant (13-02), an NHMRC Senior Research Fellowship (LJB) (1042305) and project grant (1041614).
Materials
| APC BrdU Flow Kit | BD Biosciences | 552598 | Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer) |
| BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus | BD Biosciences | 561651 | Referred to as Permeabilization buffer |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | Referred to as Wash buffer |
| DNase | Sigma | D-4513 | |
| BD Falcon 12 x 75-mm FACS tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| BD Pharmingen Stain Buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| BD LSR FORTESSA flow cytometer | BD Biosciences | FORTESSA | |
| Pipetman | Gilson | P2, P20, P100, P1000 | |
| RPMI 1640 w/o L-Gln 500 ml | Lonza | 12-167F | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| Fetal Bovine Serum | FisherBiotec | FBS-7100113 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002-1G | |
| Falcon TC 150cm2 vented Flasks | BD Biosciences | 355001 | |
| Pipettes 25mL | Greiner | 760180 | |
| Aersol Pipettes 200µL | Interpath | 24700 | |
| Aersol Pipettes 1mL | Interpath | 24800 | |
| Centrifuge | Spintron | GT-175R | |
| CO2 incubator | Binder | C 150 | |
| AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody | Cell Signalling | 9708S | |
| Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2197S | |
| Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2348S | |
| NALM6 | DSMZ | ACC-128 |
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