Temporal Spårning av cellcykelprogression med användning av flödescytometri utan behov av synkronisering

Summary

Detta protokoll beskriver användningen av bromodeoxiuridin (BrdU) upptag för att tillåta den temporala spårning av celler som var i S-fas vid en viss tidpunkt. Tillsats av DNA-färgämnen och märkning antikropp underlättar detaljerad analys av vad som händer med S fasceller vid senare tillfällen.

Abstract

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

Introduction

Bedömningen av cellcykelfunktioner och förändringar som sker i celler under cellcykelns framskridande är grundläggande för att förstå många aspekter av biologi, särskilt cancerbiologi. Många agenter i utveckling för behandling av maligniteter har djupgående effekter på cellcykelprogression eller inducera celldöd via cellcykelberoende mekanismer. För att studera cellcykel dynamik eller celler i en särskild fas av cellcykeln, är det vanligt att synkronisera cellerna. Men synkroniseringsmetoder kan ha skadliga effekter på cellerna som studeras, potentiellt confounding de resultat som uppnåtts. ¹ Nyligen användningen av fluorescerande taggade proteiner som endast föreligger vid vissa faser av celler cykeln har tillåtit analys av cellcykelprogression i enskilda celler över tiden ^2, emellertid de celler som skall studeras behov av att vara genetiskt manipulerade för att uttrycka dessa märkta proteiner, vilket begränsar deras användning till system där detta kan läsasily uppnåtts.

Cellcykeln består av två aktiva faser: syntesen (S) fasen, där DNA replikeras och mitos (M) där celldelning sker. Dessa faser skiljs åt av tre gap faser, G _0, G ₁ och G _2. G ₀ eller passivitet, är en vilofas där cellen har lämnat cykeln, G ₁ är där cellerna ökar i storlek före DNA-replikation och _G2 där celltillväxt fortsätter mellan slutförandet av DNA-replikation, men innan celldelningen. Progressionen genom cellcykeln styrs av ett antal kontrollpunkter. G ₁ checkpoint aktiveras när miljöförhållanden inte stöder DNA-syntes och hindrar ikraftträd S-fasen. Den intra-S-fasen checkpoint eller försening kan utlösas av DNA-skador som kan resultera i avstannade replikationsgafflar. Under _G2 trohet den replikerade DNA bekräftas och om skador upptäcks då _G2 </sub> kontrollpunkt aktiveras tillåter DNA-reparation före celldelning. En sista kontrollpunkt under mitos säkerställer att kromatider har korrekt inriktade på den mitotiska plattan så att celldelning kan avklarad. ³ Aktivering av dessa checkpoints används ofta för att synkronisera cellpopulationer. Cellcykelkontrollpunkter kan aktiveras av ett antal faktorer, men i cancerbiologi den vanligaste är detektion av DNA-skada. Den DNA-skada svaret initieras av PI3-kinasliknande kinaser ataxia telangiectasia och Rad3 relaterade (ATR) och ataxia telangiectasia mutated (ATM) som aktiverar nedströms effektor kinaser Chk1 och Chk2, respektive. ³ En rad händelser aktiverar Chk1 inklusive avstannat replikering gafflar, DNA-tvärbindningar, och ultraviolett strålning skador medan Chk2 främst aktiveras genom dubbelsträngbrott.

Den vanliga metoden för att studera effekten av ändrade förutsättningar på längden av cellcykeln is för att synkronisera cellerna i en särskild fas av cellcykeln. ¹ Detta kan uppnås genom flera metoder. Celler kan separeras fysiskt baserat på storlek, täthet, sidospridning (granularitet), och cellyteexpression markörer. Mer praktiskt, kan celler synkroniseras med kemiska medel. Flera medel såsom tymidin, hydroxiurea och cytosinarabinosid kan användas för att hämma DNA-syntes i S-fasen av cellcykeln resulterar i en ackumulering av celler i S-fas som fortsätter cykling efter medlen avlägsnas. Celler behandlades med nokodazol, som förhindrar bildningen av den mitotiska spolen, gripande med en G ₂ – eller M-fas DNA-innehåll. Eliminering av serum från odlingsmediet resulterar i en ackumulering av celler vid G ₀ fasen. Åter tillsats av näringsämnen inom kultur serum återstartar den normala cykla av cellerna. Emellertid är alla dessa synkroniseringsmetoder störa normal cykling och tillväxt av celler och kan Result betydande celldöd.

Synkronisering av akut lymfoblastisk leukemiceller är särskilt utmanande och dessa celler är inte mottagliga för genetisk manipulation. Den här beskrivna metoden medger en bedömning av cellcykelns dynamik och studiet av celler i specifika faser av cellcykeln utan traditionell synkronisering eller genetisk modifiering. Denna metod kan också vara till nytta för andra celltyper där genetisk modifiering och traditionella synkroniseringsförfaranden inte lätt uppnås. Metoden bygger på den sedan länge etablerade användning av bromodeoxiuridin (BrdU) bolagsordning, som har mycket liten inverkan på kort sikt tillväxt och proliferation av celler. ⁴ Etablerade BrdU protokoll utnyttja införlivandet av BrdU i nysyntetiserat DNA under S-fasen . Detta markerar permanent celler som har varit i S-fas under BrdU exponering. Denna population kan identifieras vid senare tidpunkter genom färgning för BrdU incorporation och därigenom fungera som en synkroniserad population som kan följas och utvärderas över tiden tillåter studier av läkemedelseffekter på cellcykel transitering. BrdU behöver utsättas före antikroppsfärgning, uppnås vanligen efter DNas eller syrabehandling. ^6,7 Använda flödescytometri för att detektera inkorporerade BrdU möjliggör införande av ytterligare markörer. Det viktigaste är att använda färgämnen för att mäta DNA-innehåll, gör det möjligt att bedöma cellcykeln fas fördelning av celler som var i S-fas i början av studien. ⁸ Dessutom ytterligare yta eller intracellulära antigener kan också studeras. ⁹ Dessa kan avse cellcykelhändelser såsom Ki67 eller till synes oberoende cellfunktioner såsom apoptosmarkörer som klyvs kaspas-3. De potentiella tillämpningar begränsas av fantasin hos utredaren.

Protocol

Protokollet som beskrivs här använder akut lymfoblastisk leukemi-cellinjen NALM6 men kan tillämpas på andra celltyper. 1. Lösningar och reagens Fullständigt RPMI Lägg 56 ml fetalt kalvserum (FCS) och 5,5 ml 200 mM L-glutamin till en 500 ml flaska RPMI-1640-medium. BrdU Förrådslösning Förbered 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) i Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS). BrdU fullständigt RPMI Lägg 6.2 pl Br…

Representative Results

Denna metod kan användas för att erhålla en mängd information. Några program beskrivs här. Bedömning av varaktigheten av cellcykeln För att bestämma den tid som erfordras för celler att passera genom cellcykeln, skördas celler vid olika tidpunkter efter BrdU pulsen. Intervallen mellan bedömningarna kan anpassas till de speciella celler som analyserats. Hematopoietiska cellinjer bedömdes varje timme under en 24 h period i frånvaro av någon läkemede…

Discussion

Förmågan att analysera cellcykeln är viktigt för förståelsen av cancerbiologi och verkningsmekanismen av båda läkemedlen och gener som påverkar cellproliferation och tillväxt. Medan det finns en mängd olika analyser som enligt uppgift mäter cellproliferation, endast majoriteten ge ett mått som anger antalet celler närvarande. Dessa inkluderar analyser som mäter antalet celler genom direkt visualisering och räkna, metabolisk aktivitet eller ATP koncentration. Den största fördelen med många av dessa met…

Materials

APC BrdU Flow Kit	BD Biosciences	552598	Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer)
BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus	BD Biosciences	561651	Referred to as Permeabilization buffer
BD Perm/Wash Buffer	BD Biosciences	554723	Referred to as Wash buffer
DNase	Sigma	D-4513
BD Falcon 12 x 75-mm FACS tubes	BD Biosciences	352008
BD Pharmingen Stain Buffer	BD Biosciences	554656
BD LSR FORTESSA flow cytometer	BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman	Gilson	P2, P20, P100, P1000
RPMI 1640 w/o L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
Fetal Bovine Serum	FisherBiotec	FBS-7100113
L-Glutamine	Sigma	G7513-100ML
5-Bromo-2′-deoxyuridine	Sigma	B5002-1G
Falcon TC 150cm2 vented Flasks	BD Biosciences	355001
Pipettes 25mL	Greiner	760180
Aersol Pipettes 200µL	Interpath	24700
Aersol Pipettes 1mL	Interpath	24800
Centrifuge	Spintron	GT-175R
CO2 incubator	Binder	C 150
AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody	Cell Signalling	9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb	Cell Signalling	2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb	Cell Signalling	2348S
NALM6	DSMZ	ACC-128